百日咳基因工程亞單位疫苗的實驗研究.pdf

1、百日咳是由百日咳桿菌(Bordertellapertussis)引起的一種具有強傳染性的呼吸系統(tǒng)疾病。傳統(tǒng)的全細(xì)胞和無細(xì)胞百日咳疫苗的應(yīng)用在很大程度上控制了百日咳的流行，但是由于這些疫苗本身存在的一些問題如副反應(yīng)大，保護率相對低下等使得其臨床應(yīng)用受到限制，導(dǎo)致接種覆蓋率下降。據(jù)統(tǒng)計，近年來百日咳患病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，出現(xiàn)了所謂的“復(fù)燃”現(xiàn)象；因此，有必要開發(fā)一種新型的安全有效的疫苗來取代市場上的傳統(tǒng)疫苗。近年來的研究表明，基因工程

2、疫苗有望成為繼全細(xì)胞和無細(xì)胞百日咳疫苗以來的第三代百日咳疫苗，而亞單位疫苗是目前基因工程疫苗最常見的形式。 與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程亞單位疫苗具有明顯的優(yōu)勢。表現(xiàn)在：設(shè)計靈活，針對性強，可選擇優(yōu)勢抗原進行合理的組合設(shè)計，安全性高，成本低廉，能夠誘導(dǎo)高效、特異的免疫應(yīng)答等。近年來，亞單位疫苗在感染性疾病的疫苗研究中取得了明顯的進展，正逐步成為疫苗研究的主要方向。 安全有效的候選抗原的篩選是研制亞單位疫苗的重要前提，理想的重

3、組亞單位疫苗應(yīng)該是能引起顯著保護性免疫應(yīng)答的最小、無毒的蛋白片段。目前，關(guān)于百同咳桿菌亞單位疫苗的研究還比較少，而且用于研究的抗原成分主要是百日咳毒素(pertussistoxin，PT)、絲狀血凝素(filamentoushemagglutinin，F(xiàn)HA)和百日咳桿菌粘著素(Pertactin，Prn)。由于這些抗原成分分子量都很大，直接重組表達(dá)基本不可能，現(xiàn)在的研究主要是從中篩選具有免疫原性的片段并對其保護性進行研究。近年來研究表

4、明，百日咳毒素S1亞單位突變體9K/129G(S1’)和位于FHA羧基端的一個包含456個氨基酸的片斷(FHA’)具有良好的免疫原性，免疫動物后能產(chǎn)生特異性保護性抗體，并在百日咳桿菌攻毒實驗中取得了良好的實驗效果。然而，在前期實驗中，我們成功的把這兩個片段及其融合基因克隆到了真核表達(dá)載體pET22b，28a，30a，pTRC99AandpQE30中，除了S1’在pQE30中有低量表達(dá)外，其他均不能表達(dá)，因此，如何提高這些蛋白的表達(dá)量是我

5、們需要首先解決的問題。 基于上述認(rèn)識，本課題主要進行了以下實驗研究。 一、抗原的進一步篩選鑒于S1’本身已經(jīng)比較小，本研究考慮從FHA’中篩選具有良好免疫原性的片段進行克隆表達(dá)。采用軟件DNAstar對FHA’的抗原性、親水性、柔韌性和表面可及性進行綜合分析，篩選出了一個具有良好免疫原性的片段Fs。采用該片段構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET22b-Fs在大腸桿菌BL21中獲得了高效表達(dá)(50％以上)。WesternBlot結(jié)果顯示，

6、該蛋白能與一株抗FHA全長的單抗反應(yīng)，說明該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，含有FHA片段中的優(yōu)勢表位，是良好的百日咳疫苗候選抗原。 二、疫苗候選蛋白的克隆表達(dá)與純化在成功篩選Fs的基礎(chǔ)上，我們試圖通過將該片段與S1’融合表達(dá)，間接提高后者的表達(dá)量。采用重疊延伸PCR的方法將Fs和S1’以適當(dāng)?shù)膌inker相連，獲得了融合基因FsS1’，該基因克隆至原核表達(dá)載體pET22b后，得到的重組工程菌pET22b-FsS1’/BL21獲得了高

7、效表達(dá)(30％)，成功解決了S1’難以表達(dá)的技術(shù)瓶頸。在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了重組工程菌pET22b-FsS1’S1’/BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白的表達(dá)量約為15％。采用不同的純化方案對以上三個蛋白分別進行了純化，純化后的蛋白純度均達(dá)到90％以上，滿足了后續(xù)實驗的需求。 三、疫苗候選蛋白的生物學(xué)活性研究實驗證實，重組蛋白Fs、FsS1’和FsS1’S1’基本喪失了天然S1所具有的不良的生物學(xué)活性，它們都不能明顯的誘導(dǎo)小鼠白細(xì)

8、胞升高和CHO細(xì)胞聚集，其與對照組(S1、PT)之間存在顯著差異(p＜0.01)。將FsS1’和rFsS1’S1’分別免疫家兔，ELISA證實：獲得的多抗血清能夠與天然的PT和FHA相結(jié)合。FsS1’和FsS1’S1’多抗血清抗PT效價分別為1:128000和1:256000；抗FHA抗體效價均為1:256000。雙向免疫擴散實驗得到了類似的結(jié)果。證實這兩個融合蛋白具有良好的免疫原性。 四、動物保護實驗通過預(yù)試驗獲得疫苗蛋白的最

9、佳免疫劑量和百同咳桿菌的最佳攻毒濃度。以Al(OH)3為佐劑，將重組蛋白Fs、FsS1’和FsS1’S1’采用腹腔注射的方式免疫小鼠，收集免疫血清檢測其特異性抗PT和FHA抗體水平，證實其與對照組相比存在一定差異，通過腦腔攻毒試驗檢測疫苗的免疫保護效應(yīng)。 綜上所述，本研究成功的從FHA中預(yù)測出了一個具有良好免疫原性的片段Fs，將其與S1’融合表達(dá)后獲得了后者的高效表達(dá)，并對Fs和融合蛋白FsS1’和rFsS1’S1’分別進行了純