致軸索型GBS空腸彎曲菌的wla基因簇序列對比研究.pdf

1、目的：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，C.jejuni)是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致細菌性腹瀉的主要病原菌之一，部分吉蘭.巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)是發(fā)生于C.jejuni感染后的周圍神經(jīng)疾病。根據(jù)不同的神經(jīng)生理學(xué)和病理學(xué)特點，GBS被分為急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(AIDP)、急性運動軸索性神經(jīng)病(AMAN)、和Miller-Fisher綜合征(MFS)等幾種亞型。現(xiàn)有大量研究表

2、明空彎表面的脂寡糖(LOS)成分和周圍神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)苷脂之間的分子模擬導(dǎo)致免疫損傷是空彎感染后GBS的主要發(fā)病機制。Wla基因簇編碼的多種蛋白參與了細菌表面LOS的生物合成。 本研究從基因突變的角度出發(fā)，選擇華北地區(qū)具有致AMAN型GBS特性的三株空腸彎曲菌菌株，對其LOS合成相關(guān)的wla基因簇序列進行測定，以了解華北地區(qū)致軸索型GBS的空彎菌株核酸序列特征，并同GenBank中的空彎菌株相應(yīng)序列進行對比分析，尋找基因突變和變異與

3、致病性的關(guān)系，及菌株的基因地域特點。 方法：1 細菌培養(yǎng)選取分離自華北地區(qū)AMAN型GBS病人的C.jejuni菌株。血清分型為pennerO:19型，pennerO:2型，pennerO：5型。采用李春巖院士的培養(yǎng)方法培養(yǎng)C.jejuni。 2、DNA提取應(yīng)用promega 公司的Wizard基因提取試劑盒，提取C.jejuni基因組DNA。 3.PCR擴增參考以往文獻，進行PCR擴增，經(jīng)電泳證實PCR產(chǎn)物。

4、 4、測序和拼接PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳證實后，由上海生物公司測序。以已知序列為模版，利用末端重復(fù)序列拼接測序結(jié)果得到wla基因簇完整序列。 5、進化分析應(yīng)用Mega version 4軟件，計算3株C.jejuni的wla基因簇序列同GeneBank中已知全基因組序列的6株C.jejuni相應(yīng)位點的遺傳距離并構(gòu)建進化樹。 6、序列對比應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST，將得到的3株C.jejuni的wla基因簇序列與空腸彎曲

5、菌NCTC11168菌株相應(yīng)序列進行對比分析，找出存在的突變。 結(jié)果：1 拼接后得到的3株菌的wla基因簇全長約13kb，其中l(wèi)ulei株與NCTC11168株相似，編碼11個開放讀碼框，qiaoyuntao株和zhanxing株wla基因簇編碼12個開放讀碼框。在wlaK和wlaI之間，qiaoyuntao株和zhanxing株比lulei株多出wlaJ。三株菌wla基因簇的GC含量都在29.7％左右。 2、lulei

6、株、qiaoyuntao株和zhanxing株的wla基因簇分別與RM1221株、NCTC11168株、81-176株相似程度最高，但在zhanxing株中，基因的相似程度有差異，其中wlaC、wlaD、wlaE、wlaG、wlaH、wlaI與81-176同源性最高，從wlaM到wlaJ，這四個相鄰的ORF與NCTC11168株相似度最高。以基因簇中的單個基因為單位的進一步分析結(jié)果顯示，這9株C.jejuni的聚類關(guān)系并不一致，本地菌株

7、在一些基因中存在聚類現(xiàn)象。 3、本研究菌株與NCTC11168菌株序列分析結(jié)果表示菌株之間核苷酸序列同源性達98％以上。三株細菌wla基因簇的基因存在不同程度的突變。lulei株共有134個堿基變化，導(dǎo)致30個氨基酸突變，wlaB、wlaE、wlaL及wlaM表達中斷；qiaoyuntao株共有24個堿基改變，導(dǎo)致3個氨基酸突變，wlaG、wlaK、wlaM的表達中斷；zhanxing株共有221個堿基改變，導(dǎo)致37個氨基酸突變

8、，wlaB、wlaG、wlaK表達中斷。在這些突變中，lulei株與zhanxing株共有7個相同的氨基酸突變。 結(jié)論：對三株致GBS空腸彎曲菌wla基因簇的序列測定和進化分析得到菌株的序列特征及與其他菌株的親緣性。以基因簇中的單個基因為單位構(gòu)建進化樹的結(jié)果顯示，本地菌株在wlaK、wlaM以及其它一些基因中存在聚類現(xiàn)象，這些基因中可能具有本地菌株基因特征。與NCTC11168的對比分析發(fā)現(xiàn)三株菌的wla基因簇存在多處突變，導(dǎo)致