水禽空腸彎曲菌流行病學(xué)及分離株的多位點(diǎn)序列分型分析.pdf

1、彎曲菌(Campylobacter)是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的細(xì)菌性腸道病原菌，對(duì)人類致病的主要是空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌，能引起散發(fā)性和地方流行性的胃腸炎暴發(fā)，由其引起的彎曲菌病病例在世界各地普遍呈上升趨勢(shì)。彎曲菌廣泛存在于家禽家畜的腸道和自然環(huán)境中，水禽是導(dǎo)致人彎曲菌感染的潛在宿主，感染的動(dòng)物通常無(wú)明顯病癥，但可長(zhǎng)期向外界排菌，通過(guò)排泄物污染食物和飲水，引起人類及其它動(dòng)物感染。因此，控制或清除水禽彎曲菌是預(yù)防和控制人彎曲菌感染的重要前提之一

2、。
　　 ㈠水禽彎曲菌流行現(xiàn)狀和耐藥性調(diào)查與分析。
　　 2007年12月至2009年12月，采集江蘇部分地區(qū)的鵝源、鴨源和江蘇、山東、安徽雞群樣品進(jìn)行空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌流行病學(xué)調(diào)查。15個(gè)水禽群體中，空腸彎曲菌陽(yáng)性的有12個(gè)、陽(yáng)性率為80.0％，結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性的有7個(gè)、陽(yáng)性率為53.33％。在2182份水禽泄殖腔棉拭樣品中，共檢測(cè)出380份空腸彎曲菌陽(yáng)性、陽(yáng)性率為17.42％，16份結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性、陽(yáng)性率為0.73

3、％，其中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌混合感染的樣品為6份，陽(yáng)性率為0.27％。其中，在850份鵝泄殖腔棉拭樣品中，空腸彎曲菌平均陽(yáng)性率為34.94％、結(jié)腸彎曲菌平均陽(yáng)性率為0.82％；在1332份鴨群泄殖腔棉拭樣品中，空腸彎曲菌陽(yáng)性率為6.23％、結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性率為0.68％。不同水禽群感染率懸殊較大，空腸彎曲菌陽(yáng)性率從0到65.52％、結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性率從0到1.85％。數(shù)據(jù)分析顯示，鵝群空腸彎曲菌感染率極顯著高于鴨群感染率(p＜0.01)，

4、活禽市場(chǎng)鵝群感染率顯著高于養(yǎng)殖場(chǎng)中鵝群感染率(p＜0.05)；活禽市場(chǎng)鴨群空腸彎曲菌感染率極顯著大于養(yǎng)殖場(chǎng)中鴨群感染率(p＜0.01)。
　　 在960份雞泄殖腔棉拭樣品中，共檢測(cè)出251份空腸彎曲菌陽(yáng)性、陽(yáng)性率為26.15％，36份結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性、陽(yáng)性率為3.75％，其中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌混合感染的樣品為15份、陽(yáng)性率為1.56％；不同雞群感染率懸殊較大，空腸彎曲菌陽(yáng)性率從7.58％到73.08％、結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性率從0到5

5、.77％。5個(gè)雞群均為空腸彎曲菌陽(yáng)性，群體陽(yáng)性率為100％、結(jié)腸彎曲菌群體陽(yáng)性率為80％，數(shù)據(jù)分析顯示，規(guī)?；︷B(yǎng)條件下雞群的空腸彎曲菌攜帶率顯著高于散養(yǎng)雞(p＜0.05)。進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查表明，混合養(yǎng)殖方式中鵝群和雞群的空腸彎曲菌感染率極顯著高于單一養(yǎng)殖方式的感染率(p＜0.01)。
　　 水禽彎曲菌流行病學(xué)調(diào)查表明，水禽特別是鵝群是彎曲菌的重要宿主，是彎曲菌感染流行和環(huán)境污染的重要因素。
　　 54株鵝源、36株

6、鴨源和11株雞源分離株的耐藥性分析顯示，對(duì)8大類20種抗生素高度敏感的是：阿齊紅霉素(AZM)96.04％、紅霉素(E)91.09％、慶大霉素(CN)82.18％，高度耐藥的是：頭孢哌酮(CFP)100.00％、青霉素G(P)93.07％、頭孢拉定(CE)98.02％、恩諾沙星(ENR)80.2％、環(huán)丙沙星(CIP)82.18％、復(fù)方新諾明(SXT)97.03％、四環(huán)素(TE)83.17％、強(qiáng)力霉素(DO)82.18％。耐藥菌株的多重耐

7、藥分布于4耐到18耐不等，其中11耐至12耐最多，占47.52％。
　　 不同禽源空腸彎曲菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較表明，分離株均對(duì)頭孢菌素類的頭孢哌酮和頭孢拉定、青霉素G及磺胺類藥物產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，水禽源分離株對(duì)頭孢克羅產(chǎn)生的耐藥性顯著低于雞源(p＜0.01)，而對(duì)喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素，雖然水禽源分離株也產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，但低于雞源分離株的耐藥性。對(duì)其它種類抗生素，各不同源分離株之間的耐藥性差別較小。
　　 ㈡

8、雞空腸彎曲菌對(duì)水禽傳播途徑分析。
　　 雞群是全球公認(rèn)的彎曲菌的主要宿主之一，為研究雞群體內(nèi)空腸彎曲菌能否傳播給水禽，本研究通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒pUOA18-dsRed，并將其用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至空腸彎曲菌分離株SOC0612-2，成功獲得重組菌SOC0612-2-pUOA18-dsRed，體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明質(zhì)粒pUOA18-dsRed在無(wú)抗性CCDA固體培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代25次后仍能穩(wěn)定存在。將該重組菌作為標(biāo)簽細(xì)菌研究空腸彎曲菌

9、在水禽和雞之間可能的傳播途徑。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物分成5個(gè)試驗(yàn)組，每只動(dòng)物從1日齡養(yǎng)至4周齡。第一組放置8只籠養(yǎng)鴨子，接種方式為肌肉注射；第二組平行放置兩個(gè)籠子，分別各養(yǎng)殖8只雞和鴨子，接種方式為對(duì)雞進(jìn)行口服；第三組放置8只籠養(yǎng)鴨子，每日將第二組雞的糞便喂食于改組鴨子；第四組放置籠養(yǎng)的雞鴨混合飼養(yǎng)，雞鴨各8只，接種方式為對(duì)雞進(jìn)行口服；第五組放置兩個(gè)籠子，分別各養(yǎng)殖8只雞和鴨子，作為空白對(duì)照。
　　 空腸彎曲菌在水禽與雞之間的傳播實(shí)驗(yàn)

10、表明，在第3、6、9、12、15、18天各組鴨子泄殖腔的檢測(cè)結(jié)果顯示，雞鴨混合養(yǎng)殖組中的鴨子首先被重組標(biāo)簽空腸彎曲菌感染，鴨子感染的數(shù)量一直呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其它組鴨子(除空白組之外)均在第6天被重組空腸彎曲菌感染，感染的數(shù)量也呈現(xiàn)一種上升的趨勢(shì)。在第18天的檢測(cè)結(jié)果中，經(jīng)糞便傳播和雞鴨混合養(yǎng)殖的兩組均有超過(guò)一半的鴨子被感染，其它兩組也有一半的鴨子被感染。
　　 雞、鴨混合養(yǎng)殖組中，鴨子首先被空腸彎曲菌感染，泄殖腔排菌量約為125

11、0CFU/只，并在第6天達(dá)到最高排菌量，約為4000CFU/只，其它三組鴨子也均在第6天達(dá)到最高排菌量。之后隨著時(shí)間的推移，各組鴨子排菌量保持水平趨勢(shì)。
　　 研究表明，水禽與雞之間的空腸彎曲菌以多種途徑進(jìn)行傳播，呈現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化，但主要以消化道傳播為主。同時(shí)，雞群周圍的糞便、飼料和水以及環(huán)境中的空氣粉塵均對(duì)水禽的感染具有重要影響。不同禽群的分開(kāi)養(yǎng)殖以及保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生將有助于降低彎曲菌感染傳播。
　　 ㈢不同源

12、空腸彎曲菌分離株多位點(diǎn)序列分型研究。
　　 選取空腸彎曲菌7個(gè)管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt、uncA，對(duì)不同來(lái)源的167株空腸彎曲菌分離株和2株標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型研究。結(jié)果表明，167株分離株共分成94種不同的序列型，分屬18種同源復(fù)合體和獨(dú)特型。有60株細(xì)菌分屬45個(gè)新序列型，其中，20株細(xì)菌存在新等位基因序列，新等位基因序列的數(shù)量分別為aspA(n=3)、glnA(n=5)、gltA(

13、n=5)、glyA(n=2)、pgm(n=1)、tkt(n=6)，uncA中沒(méi)有新等位基因序列。
　　 等位基因數(shù)量最多的是glnA(n=26)，最少的是uncA(n=11)。94種不同的序列型中，屬于ST-353同源復(fù)合體的序列型有9種，占總序列型的9.57％，ST-21、ST-45、ST-52和ST-692同源復(fù)合體各包含6種序列型，分別占總序列型的6.38％。另外，屬于獨(dú)特型的序列型共27種，占總序列型的28.72％。包含

14、菌株數(shù)最多的同源復(fù)合體是ST-353，共有20株，占總分離株的12.0％，其次為ST-354同源復(fù)合體和ST-45同源復(fù)合體。具有同源復(fù)合體的菌株占總數(shù)的76.6％，屬于獨(dú)特型的細(xì)菌占總分離株的23.4％。含菌株數(shù)排前8位的同源復(fù)合體涵蓋了102株，占總數(shù)的61.1％。人源、雞源、牛源、食品源、寵物源和水禽源分離株中這8種主要同源復(fù)合體所包含的分離株分別占該來(lái)源分離株的51.70％、60.40％、65.00％、80.00％、80.00％

15、和68.40％，為優(yōu)勢(shì)同源復(fù)合體。
　　 包含菌株數(shù)最多的序列型ST-354，共有11株，占總數(shù)的6.59％，含有2株或2株以上分離株的序列型共有35種，其余59種序列型只含有1株細(xì)菌。60株人源分離株中，屬于獨(dú)特型的分離株共18株，除此之外，ST-353同源復(fù)合體包含的人源菌株最多，共有12株細(xì)菌，占人源總分離株的20.0％；48株雞源分離株中，屬于獨(dú)特型的分離株共13株，除此之外，ST-354和ST-574同源復(fù)合體包含的雞

16、源菌株最多，分別含有10株和9株細(xì)菌，分別占雞源總分離株的20.83％和18.75％；20株牛源分離株中，ST-22同源復(fù)合體含有9株細(xì)菌，占牛源總分離株的45.0％；10株食品源分離株中，8株細(xì)菌分屬ST-353、ST-354和ST-45同源復(fù)合體；10株寵物源分離株分屬6種同源復(fù)合體，其中含菌株最多的是ST-45同源復(fù)合體，共3株；19株水禽源分離株中，7株細(xì)菌屬于ST-692同源復(fù)合體，占36.84％。
　　 在所獲得的9

17、4種序列型中，共有21種序列型含有兩種或兩種以上不同來(lái)源的空腸彎曲菌分離株，其中ST-354和ST-137兩種序列型分別各含有4種不同來(lái)源的分離株，另有19種序列型含有2種不同來(lái)源的空腸彎曲菌分離株。21種序列型所包含的細(xì)菌中，含有人源的序列型有15種，該15種序列型中除了含有人源分離株之外，同時(shí)還含有其它來(lái)源細(xì)菌。
　　 通過(guò)UPGMA作圖對(duì)空腸彎曲菌進(jìn)行遺傳聚類分析，選擇相鄰序列型之間有4個(gè)或4個(gè)以上的管家基因位點(diǎn)序列是相同

18、的，可將167株分離株和兩株標(biāo)準(zhǔn)株共96種序列型分為9個(gè)克隆組群和1個(gè)單獨(dú)型，其中組群5占有的序列型最多，達(dá)55種序列型。
　　 分子分型研究表明，MLST可作為研究空腸彎曲菌傳播來(lái)源、分子流行病學(xué)和種群結(jié)構(gòu)研究的有力工具。人源、雞源、牛源、水禽源、食品源和寵物源空腸彎曲菌分離株之間的遺傳關(guān)系分析顯示，同一種同源復(fù)合體和同一種序列型包含不同來(lái)源空腸彎曲菌分離株，表明動(dòng)物和禽肉食品與人類感染空腸彎曲菌密切相關(guān)，可能存在相同的傳染源