臨床流行病學(xué)

1、2HPV16致癌分子機(jī)制研究致癌分子機(jī)制研究2.1HPV16誘導(dǎo)的體外細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化自1983年從生殖道癌組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HPV16以來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)HPV16的分子致癌機(jī)理進(jìn)行了廣泛研究，其研究結(jié)果各異。較早的研究是SylvieSchneiberMaunoury等人［7］(1987)在角蛋白細(xì)胞系SKV中克隆出含有被整合的HPV16DNA序列的宿主細(xì)胞DNA片段。研究結(jié)果表明，這種整合在E2與L2之間打斷了HPV16DNA鏈。并產(chǎn)生一

2、個(gè)813堿基對(duì)的缺失，從而導(dǎo)致E6與E7的基因表達(dá)。在癌前損傷組織細(xì)胞就已整合有HPV16序列。Junyile等人［8］(1988)研究發(fā)現(xiàn)從HPV16陽(yáng)性的人的腫瘤組織細(xì)胞中獲得的一段分子長(zhǎng)度為4.4kb的DNA片段(T4.4)(內(nèi)含HPV16E6啟動(dòng)子、E6E7、部分E1基因和宿主細(xì)胞DNA序列)，具有完全轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞的活力，并已在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量的E6E7轉(zhuǎn)錄物存在。但是單獨(dú)的HPV16片段或細(xì)胞DNA片段卻無(wú)這種活

3、性。當(dāng)用多瘤病毒(polyomavirus)或SV40DNA的多腺苷酸化序列(片段)取代T4.4中HPV16DNA片段時(shí)，很少或者沒(méi)有觀察到轉(zhuǎn)化活性的恢復(fù)。這些結(jié)果揭示含有從人腫瘤細(xì)胞基因組分離出來(lái)的HPV16E6E7DNA片段具有轉(zhuǎn)化潛力，這種潛力只有在HPV16DNA被連接到宿主細(xì)胞DNA序列中才能實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞DNA序列比以簡(jiǎn)單提供一個(gè)多腺苷酸化DNA片段更為復(fù)雜的方式發(fā)揮作用。為了確定HPV16DNA分子中那個(gè)基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起作用

4、MasuoYutsudo等人［9］(1988)構(gòu)建了含有HPV16早期開(kāi)放閱讀框架(EF)不同亞基因片段的重組鼠源逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA，并測(cè)定了它們的惡性轉(zhuǎn)化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)E6和E7F是HPV16的轉(zhuǎn)化基因，前者在裸鼠體內(nèi)決定致瘤性，而后者在軟瓊脂中影響細(xì)胞生長(zhǎng)特性(例如細(xì)胞飽和密度與克隆形式)；并發(fā)現(xiàn)在E1E2F區(qū)域可能存在一個(gè)抑癌基因，因?yàn)楹蠩1F和E2F片段加E6和E7F片段的重組DNA的致瘤活性明顯低于僅僅只有E6和E7F片段D

5、NA。國(guó)內(nèi)張衛(wèi)等人［10］(1991)用HZIP16和HZIP16K2種質(zhì)粒，將HPV16的全早期區(qū)基因與E6、E7F片段分別轉(zhuǎn)入φ細(xì)胞，所產(chǎn)生的重組病毒能誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有接觸抑制消失，非錨地依賴性生長(zhǎng)，并可使裸鼠致瘤。結(jié)果表明，HPV16全EFDNA片段具有誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的活性。早期區(qū)基因中的E6E7Fs也可單獨(dú)誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。為了探索HPV16長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)在E6E7Fs轉(zhuǎn)化中的作

6、用，候芷英等人［11］1994構(gòu)建了含HPV16E6E7Fs(nt83855)片段和HPV16長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)加E6E7Fs片段(nt7007—79040879)的逆轉(zhuǎn)病毒載體pH21和pH18質(zhì)粒，利用瓊脂轉(zhuǎn)染法，分別將它們導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞pA317中，經(jīng)過(guò)篩選獲得G418抗性的病毒包裝細(xì)胞，產(chǎn)生的重組病毒H21和H18感染的NIH3T3細(xì)胞都具有惡性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，并能使裸鼠形成腫瘤。SouthernBlot雜交結(jié)果表明，上述兩

7、個(gè)基因片段都被整合到細(xì)胞基因組中。細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果說(shuō)明，HPV16E6E7基因片段是HPV16轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞的關(guān)鍵早期基因，但其自身的LCR在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中并沒(méi)有顯示出重要作用。蓋其偉等人［12］(1994)在體外用HPV16DNA完整分子通過(guò)磷酸鈣沉淀技術(shù)轉(zhuǎn)錄NIH3T3細(xì)胞，從而導(dǎo)致了NIH3T3細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并用Southernblot雜交證實(shí)HPV16DNA分子以整合狀態(tài)存在于NIH3T3細(xì)胞DNA中。2.2HPV16及

8、其基因組與宿主細(xì)胞抑癌基因的關(guān)系許多研究表明，HPV16及其基因組的致癌(腫瘤)性或細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化作用是由于HPV16的有關(guān)基因通過(guò)影響宿主細(xì)胞抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物生物活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Dyson和Werness分別于1989年、1990年在《Science》雜志上發(fā)表論文［13，14］，提出HPV16產(chǎn)生的兩個(gè)病毒蛋白即E6、E7蛋白可能分別捆綁并抑制宿主細(xì)胞內(nèi)的兩個(gè)關(guān)鍵性的抗癌蛋白即P53蛋白和Rb蛋白。在正常細(xì)胞內(nèi)，P53和Rb調(diào)控細(xì)胞周期

9、與凋亡，P53與Rb表達(dá)產(chǎn)物的失活可導(dǎo)致宿主細(xì)胞永生化。E6蛋白可能與P53表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合而導(dǎo)致P53降解失活，繼之使含HPV16的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)失控。MagnusNonKnebelDoebejz等人［15］(1994)用SW756宮頸癌細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)：E7蛋合位點(diǎn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)上游的重組。RTPCR實(shí)驗(yàn)表明，HPV的特殊轉(zhuǎn)錄跨越E2、E4、E5和位于HPV16控制區(qū)上游的L1L2Fs。根據(jù)這些資料，綜合起來(lái)考慮在SiHa細(xì)胞中，HPV16整合位

10、點(diǎn)上游的宿主細(xì)胞DNA區(qū)域內(nèi)含有影響位于HPV16上游控制區(qū)(URR)上游的HPV16Fs轉(zhuǎn)錄的控制元件。［7］SylvieschneiderMaunouryOdilecroissantGerardth.Intergrationofhumanpapillomavirustype16DNAsequence:apossibleearlyeventintheprogressionofgenitaltums.Journalofvirology1

11、98761:32953298.［8］JunYileVittioDefendi.Aviralcellularjunctionfragmentfromahumanpapillomavirustype16positivetumouriscompetentintransfmationofNIH3T3cells.JournalofVirology198862:44204426.［9］MasuoYutsudoYujiOkamotoAkiraHaku

12、ra.Functionaldissociationoftransfminggenesofhumanpapillomavirustype16.Virology1988166:594597.［10］張衛(wèi)，司靜懿，李昆，等.人乳頭瘤病毒16型亞基因DNA體外轉(zhuǎn)化功能的細(xì)胞學(xué)研究.病毒學(xué)報(bào)，1991，7：222225.［11］候芷英，孫亞洲，商銘，等.人乳頭瘤病毒16型E6E7F轉(zhuǎn)化作用的研究.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，1994，8：11211

13、5.［12］蓋其偉，赫翠珍，姚慶英，等.人乳頭瘤病毒16型DNA誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化.首都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，15：109111.［13］DysonNHowleyPMMungerKetal.Thehumanpapillomavirus16E7oncoproteinisabletobindtheretinoblastomageneproduct.Science1989243:934936.［14］VernessBALevine

14、AJHowleyPM.Associationofhumanpapillomavirustype1618E6proteinswithp53.Science1990248:7679.［15］MagnusvonknebeldoeberitzClaudiarittmullerFrankAengeneyndtetal.Reversiblerepressionofpapillomavirusoncogeneexpressionincervicalc

15、arcinomacells:ConsequencesfthephenotypeE6p53E7pRbinteractions.JVirol199468:28112821.［16］NakaoYYangXYokoyamaMetal.Inductionofp16duringimmtalizationbyHPV1618notduringmalignanttransfmation.BrJcancer199775:14101416.［17］DeyAA

16、tchaIABagchiS.HPV16E6oncoproteinstimulatesthetransfminggrowthfactbeta1promoterinfibroblaststhroughaspecificGCrichsequence.virology1997228:190199.［18］WildingJVousdenKHSoutterWPetal.Ecadherintransfectiondownrequlatestheepi

17、dermalgrowthfactreceptreversestheinvasivephenotypeofhumanpapillomavirustrasfectedkeratinocytes.CancerRes199656:52855292.［19］MullerCYOBoyleJdFongKMetal.AbnmalitiesoffragilehistidinetriadgenomiccomplementaryDNAincervicalca

18、ncer:associationwithhumanpapillomavirustype.JNatlCancerInst199890:433439.［20］SimpsonSWoodwthCDDipaoloJA.AlteredexpressionofErgEts2tranionfactsisassociationwithgeicchangesat21q22.222.3inimmtalcervicalcarcinomacelllines.On

19、cogene199714(18):21492157.［21］ChooKBChenCMHanCPetal.Molecularanalysisofcellularlocidisruptedbypapillomavirus16intergrationincervicalcancer:frequentviralintergrationintopologicallydestabilizedtranionallyactivechromosomalr