實(shí)時定量PCR檢測人類腹瀉糞便中空腸彎曲菌的研究與評價(jià).pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，以下簡稱C.jejuni)是近二十幾年來被普遍認(rèn)識的世界范圍廣泛流行的人獸共患病原菌，可以引起人和動物發(fā)生各種疾病。本菌為彎曲菌屬的一個種，被認(rèn)為是人類細(xì)菌性腸炎的主要病因之一。本菌致病后臨床表現(xiàn)主要有兩種：消化道癥狀和/或腸道外感染。目前本菌的檢測主要依靠實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)，包括直接培養(yǎng)法、增菌后培養(yǎng)法和過濾培養(yǎng)法。這幾種方法繁瑣、費(fèi)時，并且最后還需要做十幾種生化試驗(yàn)來鑒定，結(jié)果往往在5

2、.7天以后才有，延誤了疾病的診斷和相應(yīng)治療。因此，國內(nèi)外相繼開展了利用分子生物學(xué)及免疫學(xué)方法對空腸彎曲菌進(jìn)行快速檢測的研究，包括定性分析的PCR技術(shù)、寡核苷酸探針技術(shù)、ELISA及免疫磁珠等，但這些方法一般用于對純菌的快速篩選及食品、水源等的檢測，尚未成熟應(yīng)用于檢測人類腹瀉糞便中的空腸彎曲菌。因此，本研究欲應(yīng)用實(shí)時定量PCR技術(shù)建立快速準(zhǔn)確的空腸彎曲菌臨床診斷方法。 研究目的：建立一種快速準(zhǔn)確的方法以檢測人類腹瀉糞便中的空腸彎曲

3、菌，并將其應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)中。 材料和方法： 1.收集住院和門診腹瀉病人的糞便256例及正常人糞便50例。 2.應(yīng)用3種培養(yǎng)基(空腸彎曲菌選擇性血瓊脂、哥倫比亞血瓊脂、CCDA平板)以過濾培養(yǎng)法同時鑒定306例糞便是否含有空腸彎曲菌，以提高培養(yǎng)結(jié)果的可靠性。 3.應(yīng)用針對空腸彎曲菌ORF-C特異性片段而設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)(TaqMan探針法)，檢測空腸彎曲菌(5株)、彎曲菌菌屬內(nèi)的其他菌

4、種(6種)及其他腸道細(xì)菌(17種)，以檢驗(yàn)引物和探針的特異性。通過檢測經(jīng)倍比稀釋的空腸彎曲菌純培養(yǎng)物和模擬感染糞便標(biāo)本，以確定引物和探針的敏感性。 4.以稀釋液混勻后提取306例糞便的細(xì)菌基因組DNA，并應(yīng)用此引物和探針進(jìn)行檢測。最后比較real-timePCR和培養(yǎng)方法結(jié)果的吻合度。 5.實(shí)驗(yàn)過程中，培養(yǎng)結(jié)果和實(shí)時定量PCR結(jié)果是雙盲的，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 結(jié)果： 1.空腸彎曲菌選擇性血瓊脂和哥倫比亞血瓊脂

5、均從256例腹瀉糞便中檢測到10例陽性樣本；CCDA平板檢測到9例。3種培養(yǎng)基均未從50例正常糞便中檢出空腸彎曲菌。陽性標(biāo)本中空腸彎曲菌的濃度主要集中在約104-106CFU/g。 2.引物和探針對空腸彎曲菌高度特異，與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)。在純培養(yǎng)物和糞便中，最低檢測限分別約為102CFU/mL和103CFU/g。 3.在256例腹瀉糞便中，real-timePCR檢出12例陽性標(biāo)本。其中2例培養(yǎng)陰性而PCR陽性的標(biāo)本經(jīng)

6、測序證實(shí)為空腸彎曲菌。Real-timePCR從50例正常糞便中沒有檢出空腸彎曲菌。 4.以培養(yǎng)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，real-timePCR的特異度為99.2％，敏感度為100％，約登指數(shù)為0.992。經(jīng)McNemar檢驗(yàn)得知兩種檢測方法之間的差異無顯著性，二者吻合度較強(qiáng)(Kappa系數(shù)=0.905)。 結(jié)論： 1.引物和探針對空腸彎曲菌高度特異。敏感性試驗(yàn)表明，引物和探針的最低檢測濃度能夠適用于臨床檢測中。