彎曲菌real-time PCR技術(shù)的建立及多種定量檢測方法的比較.pdf

1、彎曲菌（Campylobacter spp）是一種重要的食源性病原菌，近幾年由彎曲菌引起的急性腹瀉病例呈較快上升趨勢。研究表明，在人類感染彎曲菌散發(fā)病例中，超過90％的病例是由于食用了污染的雞肉產(chǎn)品及其交叉污染物所致。我國已大體了解了不同宿主及食品中彎曲菌的污染狀況，但流行病學(xué)定性研究結(jié)果提供的干預(yù)措施不能量化，獲得的政策建議不夠精確。因此，需要開展快速、定量的檢測方法研究，為彎曲菌污染的定量風(fēng)險(xiǎn)評估、危害分析和防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2、>　　1、彎曲菌real-time PCR定量檢測方法的建立
　　以彎曲菌16s rRNA基因作為靶基因，建立檢測彎曲菌的real-time PCR方法。彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株、分離株均擴(kuò)增出曲線，而其他常見食源性病原菌均無擴(kuò)增，表明該方法具有較強(qiáng)的特異性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法對彎曲菌檢測限在10CFU/mL左右。熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值（Ct值）與模板濃度具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=-3.286x+40.878，R

3、2值達(dá)到0.999，批內(nèi)可重復(fù)變異系數(shù)在0.12％-0.4％之間，批間可重復(fù)變異系數(shù)為0.17％，重復(fù)性好。對樣品分別使用樣品直接熱裂解法、菌液濃縮熱裂解法和基因組試劑盒提取法提取模板DNA，并對不同制備方法的熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行了比較，最終選用菌液濃縮熱裂解法提取雞肉擦拭樣品和雞肛拭樣品模板DNA，彎曲菌DNA回收率分別為46％和19.6％，選用基因組試劑盒提取雞肉淋洗樣品模板DNA，該方法的DNA回收率為1.2％。
　　2、

4、選擇性CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法和選擇性Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法的優(yōu)化
　　本研究參照翟偉華等建立的禽肉中彎曲菌定量檢測方法，對選擇性CCDA平板中抗生素進(jìn)行濃度調(diào)整，并比較添加三種不同抗生素濃度的平板對實(shí)際樣品中彎曲菌檢測的影響，結(jié)果表明，甲氧芐氨嘧啶、利福平和放線菌酮三種抗生素濃度調(diào)整為0.01 g/L、0.01 g/L和0.1 g/L時(shí)，更有利于彎曲菌的生長，且平板上雜菌的量也不影響對彎曲菌可疑菌落的判定，采用該濃度抗生素平

5、板與純培養(yǎng)彎曲菌的符合度為（95±5）％。
　　選擇性Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法參照《我國零售雞肉中彎曲菌污染對人群健康影響的初步定量風(fēng)險(xiǎn)評估項(xiàng)目》中所采用的定量分離樣品中彎曲菌方法，通過實(shí)際樣品檢測以驗(yàn)證其有效性。
　　3、real-time PCR法、選擇性CCDA和Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法檢測整雞淋洗樣品中彎曲菌的比較
　　運(yùn)用熒光定量PCR方法、CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法和Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法同時(shí)對5

6、0份雞肉淋洗樣品進(jìn)行彎曲菌檢測。熒光定量PCR方法檢測陽性率為92％，檢測出彎曲菌數(shù)平均值為log2.03CFU/g，與國標(biāo)方法符合率為28.0％; CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法檢測陽性率為36％，檢測出彎曲菌數(shù)平均值為log1.44 CFU/g，與國標(biāo)方法符合率為60.0％; Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法檢測陽性率為56％，檢測出彎曲菌數(shù)平均值為log2.08CFU/g，與國標(biāo)方法符合率為56.0％。由于國標(biāo)方法存在漏檢現(xiàn)象，導(dǎo)致三種方法與

7、國標(biāo)方法符合率均不高。結(jié)果顯示real-time PCR法陽性檢測率高于選擇性CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法和Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法，但與國標(biāo)方法符合率最低;對于雞淋洗樣品而言，Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法陽性檢出率和陽性樣品彎曲菌數(shù)均顯著高于CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法。
　　4、real-time PCR法和CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法檢測雞肉擦拭和雞肛拭樣品中彎曲菌的比較
　　運(yùn)用熒光定量PCR方法和CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法對揚(yáng)州某農(nóng)

8、貿(mào)市場采集的68份雞肉擦拭樣品進(jìn)行彎曲菌檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測出彎曲菌陽性樣品65份，陽性率為95.6％(65/68)，檢測出彎曲菌數(shù)平均值為log2.36CFU/100cm2;選擇性CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法檢測出彎曲菌60份陽性，陽性率為88.2％(60/68)，檢測出彎曲菌數(shù)平均值為log1.25CFU/100cm2。結(jié)果顯示兩種方法的符合度為89.7％，且real-time PCR法陽性檢測率及陽性樣品彎曲菌數(shù)均高于選擇性CC

9、DA平板菌落計(jì)數(shù)法。
　　運(yùn)用熒光定量PCR方法和CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法對揚(yáng)州某農(nóng)貿(mào)市場采集的56份雞肛拭樣品進(jìn)行彎曲菌檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測出彎曲菌陽性樣品54份，陽性率為96.4％(54/56)，檢測出彎曲菌數(shù)平均值為log6.02CFU/g;選擇性CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法檢測出彎曲菌42份陽性，陽性率為75.0％(42/56)，檢測出彎曲菌數(shù)平均值為log3.50CFU/g。結(jié)果顯示兩種方法的符合度為78.8％，且rea

10、l-time PCR法陽性檢測率及陽性樣品彎曲菌數(shù)均高于選擇性CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法。
　　5、CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法和Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法檢測雞肛拭樣品中彎曲菌的比較
　　運(yùn)用選擇性CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法和Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法對18份雞肛拭樣品進(jìn)行彎曲菌檢測。選擇性Karmali平板菌落計(jì)數(shù)法檢測出9份陽性，陽性率為50％，檢測出彎曲菌數(shù)平均值為log6.02CFU/g; CCDA平板菌落計(jì)數(shù)法檢測出13份