六種植物病毒Real Time PCR定量方法的建立及其應(yīng)用.pdf

1、植物病毒的檢測(cè)是植物病毒病監(jiān)測(cè)防控中最為重要的環(huán)節(jié)之一。以往常規(guī)的血清學(xué)檢測(cè)，核酸雜交檢測(cè)和傳統(tǒng)PCR技術(shù)在植物病毒檢測(cè)應(yīng)用方面都或多或少存在著不完善的地方。因此，本研究以熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，錨定水稻條紋病毒(Ricestripevirus，RSV)、三種大麥黃矮病毒(Barelyyellowdwarfviruses，BYDVs)、小麥矮縮病毒(Wheatdwarfvirus，WDV)和黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergree

2、nmottlemosaicvirus，CGMMV)的CP序列基因保守區(qū)域，分別建立了各自的用于定量檢測(cè)的RealTimePCR方法。同時(shí)，應(yīng)用這些方法對(duì)這幾種病毒進(jìn)行了初步的定量檢測(cè)研究。主要內(nèi)容如下： 1.建立了一套用于定量檢測(cè)RSV的OneStepRealTimeRT-PCR方法。通過(guò)序列比對(duì)，在RSVCP序列保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)特異性的引物和探針；通過(guò)在GenBank中用BLAST進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)引物探針特異性很高。對(duì)RSVOne

3、StepRealTimeRT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最佳的引物和探針終濃度均為O.2μmol/L建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到20拷貝/2μl體系，曲線斜率和擴(kuò)增效率均符合定量要求。通過(guò)與ELISA檢測(cè)技術(shù)的靈敏度對(duì)比，該實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法展現(xiàn)出極高的靈敏性。對(duì)感RSV水稻不同組織內(nèi)和單頭帶毒灰飛虱體內(nèi)RSVCPRNA進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，水稻葉片中病毒RNA含量高于莖組織；雌蟲灰飛虱體內(nèi)較雄蟲攜帶有更多的病毒RNA，并且蟲

4、體的胸腹部是病毒RNA最主要的聚集區(qū)，而蟲體頭部病毒RNA含量極低。 2.針對(duì)BYDVGPV、GAV和PAV的定量檢測(cè)，分別建立了OneStepRealTimeRT-PCR方法。三套獨(dú)立的檢測(cè)體系檢測(cè)靶基因序列均位于BYDVCP保守序列上。GPV檢測(cè)探針標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，GAV檢測(cè)探針標(biāo)記CY5熒光基團(tuán)，PAV檢測(cè)探針標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，三套定量檢測(cè)體系的檢測(cè)靈敏度均可以達(dá)到50拷貝/20μl體系，曲線斜率和擴(kuò)增

5、效率均符合定量要求。通過(guò)對(duì)感病小麥的檢測(cè)證明所建立的RealTimePCR體系是成功的。 3.建立了一套用于定量檢測(cè)WDV小麥株系的RealTimePCR方法。通過(guò)序列比對(duì)，分別在WDV小麥株系CP基因和長(zhǎng)非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了兩組引物探針。其中錨定長(zhǎng)非編碼區(qū)的引物和探針組合可以很好的區(qū)分WDV小麥株系和大麥株系。使用錨定CP基因的引物探針組合建立RealTimePCR定量檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最佳的引物和探針終濃度均為0.

6、2μmol/L。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到30拷貝/20μl體系，曲線斜率和擴(kuò)增效率均符合定量要求。通過(guò)與ELISA檢測(cè)技術(shù)的靈敏度對(duì)比，該實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法展現(xiàn)出比ELISA檢測(cè)要高的多的靈敏性。通過(guò)對(duì)田間采集的26組疑似WDV侵染小麥樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，其中24組樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，病毒檢出率為92.3％。而同時(shí)采用傳統(tǒng)普通PCR進(jìn)行檢測(cè)，僅有12組樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，病毒檢出率不到50％。由此可見(jiàn)，本研究中所建立的熒光定量檢測(cè)方法相

7、對(duì)于傳統(tǒng)PCR檢測(cè)具有更高的靈敏度。對(duì)采集自病區(qū)的單頭條沙葉蟬體內(nèi)WDV進(jìn)行絕對(duì)定量，結(jié)果顯示該定量方法適合于單頭介體昆蟲帶毒量的檢測(cè)；進(jìn)而為小麥產(chǎn)區(qū)WDV介體昆蟲帶毒率分析提供了一種新穎的，靈敏的，準(zhǔn)確的手段。使用第二組引物探針，針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室采集的大麥樣品進(jìn)行WDV小麥株系的檢測(cè)。結(jié)果顯示，樣品YNKM-29，YNKM-38，YNKM-39和YNKM-43可以檢測(cè)到WDV小麥株系DNA。 4.建立了一套用于定量檢測(cè)CGMMV的

8、OneStepRealTimeRT-PCR方法，并首次將檢測(cè)靶基因錨定于病毒CP基因上。通過(guò)摸索改進(jìn)，建立了一套比較適合提取富含多糖多酚植物樣品總RNA的方法。對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最佳的引物和探針終濃度均為0.2μmol/L。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到50拷貝/20μl體系，曲線斜率和擴(kuò)增效率均符合定量要求。利用建立的定量方法對(duì)西瓜種子不同部位組織帶毒量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，子葉組織中病毒RNA含量極高，外種皮次之，內(nèi)種皮最低。由此