鴨坦布蘇病毒Real Time RT-PCR監(jiān)測方法的建立及跨種間傳播的初步研究.pdf

1、自2010年4月以來,在我國東南地區(qū)省份的部分鴨場中先后爆發(fā)了一種急性傳染病,主要引起蛋鴨產(chǎn)蛋急劇下降。鴨群患病后4~5d左右產(chǎn)蛋率可從80％~85%迅速下降至10%~30%,甚至停產(chǎn);發(fā)病率60%~100%。臨床剖檢以卵巢變性、出血、萎縮,肝臟有白色針尖狀壞死等為典型病變。該病最初在江蘇、浙江等地發(fā)生,之后在河北、山東、安徽、福建、廣東等省份的大部分鴨群中迅速蔓延開來,給我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)病毒分離及基因測序,現(xiàn)已確定該病

2、原為鴨源坦布蘇病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)。
　　本研究為建立一種針對DTMUV的快速、敏感、特異的Real-Time RT-PCR診斷方法,首先根據(jù)DTMUV安徽分離株AH-10株E基因序列為模板(GenBank登錄號:JQ957513)設(shè)計特異性引物,將E基因全長克隆至具有T7啟動子的載體pBSK上,經(jīng)測序無誤后以該質(zhì)粒為模板,在T7RNA聚合酶作用下合成E基因RNA序列,將該RNA提純后作為Rea

3、l-Time RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品模板。在E基因中間再設(shè)計一對特異性引物用于PCR擴(kuò)增,使用熒光嵌合染料SYBR GreenⅠ,通過對反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化,最終本研究建立起一種特異性高,敏感性強(qiáng)的DTMUV一步法Real-Time RT-PCR檢測方法。該方法最低可檢測到20拷貝的病毒核酸,比普通RT-PCR高1000倍以上,且以其他常見禽病病原核酸作為模板無非特異擴(kuò)增,具有良好的特異性。
　　臨床樣品檢測顯示,普通RT-PC

4、R樣品陽性檢出率為35.1%(59/168),Real-Time RT-PCR方法檢出率為73.8%(124/168);動物回歸實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果,普通RT-PCR陽性樣品總檢出率為30.2%(29/96),Real-Time RT-PCR方法陽性總檢出率為64.6%(62/96),表明該實(shí)驗(yàn)建立的Real-Time RT-PCR檢測方法明顯高于普通RT-PCR。本研究為DTMUV感染的臨床診斷提供了一種快速、敏感、特異的診斷方法,同時也為D

5、TMUV的流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究提供必要的技術(shù)支持。
　　為探索新發(fā)鴨坦布蘇病毒是否具有跨物種感染人的能力及可能存在的致病性,本研究以Balb/c小鼠作為哺乳動物模型,第一次動物試驗(yàn)分別以105、104、103TCID5劑量病毒分別通過腹腔及顱內(nèi)接種方式感染小鼠,感染后每天觀察記錄小鼠體重變化及發(fā)病情況,直至小鼠完全死亡或康復(fù)。重復(fù)進(jìn)行上述動物試驗(yàn),在發(fā)病轉(zhuǎn)歸期處死各組半數(shù)小鼠,分離血清,對此時血清中DTMUV總抗體水平及特異性

6、IgG及IgG亞類進(jìn)行檢測,同時采集肝、腎、脾、腦,對這些臟器中病毒含量進(jìn)行檢測,以此來分析DTMUV感染小鼠后引起的小鼠天然免疫應(yīng)答以及病毒在組織中的增殖情況。另外,為了探究DTMUV對哺乳動物是否存在抗體依賴增強(qiáng)作用(ADE),本試驗(yàn)對腹腔接種方式感染14天后的小鼠進(jìn)行病毒的二次腹腔接種途徑感染,觀察小鼠的臨床癥狀,在小鼠發(fā)病最嚴(yán)重時處死小鼠,對其血清中特異性IgG及臟器中病毒含量進(jìn)行檢測,分析DTMUV對小鼠的抗體依賴增強(qiáng)作用,最

7、后并對該試驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果顯示,DTMUV以顱內(nèi)接種方式感染小鼠時候,病毒可在小鼠的組織臟器中進(jìn)行增值,尤其以腦組織中病毒含量最高,病毒核酸最高可達(dá)3000~4000copies/mg;脾臟中病毒含量僅次于腦,肝臟中病毒含量最低約800~600copies/mg。感染小鼠還表現(xiàn)為體重降低、采食廢絕,腦部有輕微出血等癥狀,同時該病毒感染后小鼠還產(chǎn)生高水平的中和抗體,其中105TCID50劑量組中IgG及IgG2a濃度可達(dá)1

8、00μg/mL以上,而104TCID50及103TCID50劑量組顯著低于105TCID50劑量組。另外,DTMUV對小鼠有明顯的抗體依賴增強(qiáng)作用,二次感染后4天小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)病癥狀,并可在其組織中檢測到約350~1000copies/mg的病毒核酸,特異性IgG含量也極顯著高于二次感染前水平。
　　研究結(jié)果表明DTMUV具有一定的跨物種傳播引起哺乳動物發(fā)病的能力,并且該病毒可對哺乳動物產(chǎn)生抗體依賴增強(qiáng)作用。然而DTMUV是否