腸道病毒71型熒光RT-PCR檢測方法的建立及評價.pdf

1、目的：
　　 腸道病毒71型(Enterovirus71)是引起手足口病(HFMD)的重要病原，大都是幼兒感染，引起發(fā)熱，典型癥狀是在手心、腳心、口腔以及臀部出現(xiàn)多個水泡潰瘍。還會引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，會導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥和后遺癥，甚至死亡。
　　 EV71經(jīng)典的診斷方法“金標準”是病毒培養(yǎng)分離。但是這種方法需要幾個星期的時間，而且會由于病毒滴度低或者抗原漂移而阻礙。分子生物學(xué)方法如P

2、CR技術(shù)，以用于特異性的檢測EV71核酸，而且被證實比病毒分離方法更靈敏。最近，熒光PCR實驗室病毒的鑒定上已得到廣泛認可，因為它高靈敏性特異性，能快速檢測。通過熒光的發(fā)射在擴增反應(yīng)過程中的實現(xiàn)了實時檢測。
　　 隨著EV71致的手足口病引起越來越多的關(guān)注，迫切需要一種快速而特異的方法檢測出EV71，并能與其它腸道病毒鑒別，比如CA16，?？刹《镜?。本文建立一種熒光RT-PCR技術(shù)，快速、敏感的從臨床標本中檢測EV71的DNA。

3、
　　 方法：
　　 根據(jù)GeneBank發(fā)表的EV71全基因組序列，設(shè)計特異的引物與探針；用RT-PCR擴增出226bp的片段，通過純化后，轉(zhuǎn)化入PGM-T載體中(TA克隆)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。PCR鑒定DNA測序證實構(gòu)建質(zhì)粒成功。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，優(yōu)化最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，建立最優(yōu)化的實時定量PCR方法。評價其靈敏性、特異性和可靠性，并用于檢測臨床標本，同時與傳統(tǒng)RT-PCR和病毒分離檢測方法比較評價其應(yīng)用價值

4、。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)TA克隆成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒。
　　 2.以重組質(zhì)粒為模板，確定定量RT-PCR反應(yīng)體系如下：RT-PCR Buffer10μl；EX Taq-HS0.2μl；RT Enzyme Mix2.0μl；引物0.8μl；探針0.4μl；模板RNA2.0μl總體積為20μl。反應(yīng)條件：42℃5 min；95℃10sec；95℃5sec，60℃30sec；40cycles；60℃10 min。

5、
　　 3.方法學(xué)的評價結(jié)果：繪制了以模板拷貝數(shù)為分析指標的定量標準曲線，相關(guān)方程為Y=-3.370X+49.790，r值為0.994，線性范圍較寬(102～108copies/μl)。敏感性：54份經(jīng)測序鑒定后，確定為EV71的標本，用構(gòu)建的熒光RT-PCR法方法檢測均為陽性。本方法絕對檢測低限(即能被檢測到的模板起始拷貝最低數(shù))為103拷貝/μl，傳統(tǒng)的RT-PCR檢測方法絕對檢測低限為104拷貝/μl，提高了100倍。特異

6、性檢測結(jié)果：CA16、?？刹《?、輪狀病毒、乙腦病毒等無特異性擴增?？煽啃裕翰煌瑫r間檢測同一份標本的變異系數(shù)小于11％。
　　 4.對臨床標本進行檢測，熒光RT-PCR法的檢測EV71的陽性率是61.2％。病毒分離法和普通RT-PCR法檢測的陽性率分別是是16.4％、52.4％。
　　 結(jié)論：
　　 本研究建立的腸道病毒EV71-TaqMan熒光定量PCR方法，具有特異、靈敏、快速的特點，適用于由EV71感染引起的