多重?zé)晒舛縍T-PCR同時(shí)檢測(cè)甲型乙型流感病毒方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、目的 建立一種快速、敏感、特異的多重?zé)晒舛縍T一PCR同時(shí)檢測(cè)甲型乙型流感病毒，并將建立的方法進(jìn)行初步臨床應(yīng)用研究。 方法 1．甲型乙型流感病毒的引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)，選取兩種病毒的基因序列保守區(qū)，根據(jù)引物設(shè)計(jì)軟件DNASTAR設(shè)計(jì)引物和探針。對(duì)甲型乙型的探針標(biāo)記不同的熒光素，甲型標(biāo)記FAM，乙型標(biāo)記VIC。 2．多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系中，甲型乙型流感病毒的兩套引物及兩種探針濃度的優(yōu)化

2、。 3．對(duì)甲3／悉尼／5／97、乙／深圳／12／97流感病毒進(jìn)行病毒效價(jià)滴定(106TCID50／m1)，TCID．~oE口是組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染劑量，然后稀釋成100、10、1、0．1、O．0l、0．001TCID．~o，提取病毒RNA作為敏感度的標(biāo)準(zhǔn)，多重?zé)晒舛縍T一PCR反應(yīng)和常規(guī)的RT-PCR以及和病毒分離培養(yǎng)的靈敏度作比較。 4．在多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系中加入其它的呼吸道病毒提取的RNA，檢測(cè)反應(yīng)體

3、系的特異性． 5．用多重?zé)晒舛縍T-PCR在對(duì)40例疑似流感含漱液標(biāo)本進(jìn)行初步的應(yīng)用． 結(jié)果 1．引物與探針的設(shè)計(jì)與合成：我們選取甲型流感、乙型流感高度保守區(qū)，甲型選取編碼基質(zhì)蛋白(M)區(qū)，乙型選取編碼血凝素基因區(qū)(HA)。甲型流感的探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA，乙型流感的探FluA-1F:5'-GGACTGCAGCGTAGACGCTT-3'核酸位點(diǎn):217-236

4、FluA-2R:5'-CATCCTGTTGTATATGAGGCCCAT-3'382-405FluA-3R:5'-CATTCTGTTGTATATGAGGCCCAT-3'382-405FluAprobe:5'-CTCAGTTATTGTGCTGGTGCACTTGCCA-3'349-376FluB-1F:5'-AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA-3'970-995FluB-2R:5'-CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA

5、-3'1119-1139FluBprobe:5'CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC-3'1024-1050針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是VIC，3’端標(biāo)記的與甲型一樣。設(shè)計(jì)的甲型流感有兩條反向引物，只有在5’第4個(gè)堿基不同，目的是為了擴(kuò)增出所有的甲型流感的亞型。引物和探針的序列： 2．多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系中引物及探針的濃度優(yōu)化：兩套引物的濃度分別配成200、400和600nmol／L，甲型乙型探針的

6、濃度分別配成100、200、300nm01／L，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，以0．4umol／L的甲型引物濃度與0．6umol／L的乙型引物濃度及兩種探針的濃度分別為200nmol／L獲得的Ct值較小而熒光強(qiáng)度最大。在該條件下，多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系最合適。 3．多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系的靈敏度：多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)在兩種參考病毒效價(jià)滴度稀釋0.001TCID,~o倍時(shí)，檢測(cè)甲型流感的Ct值為3

7、5．12，檢測(cè)乙型流感的Ct值為33．06，檢測(cè)呈陽性，常規(guī)的RT-PCR在稀釋至0．1TCIDs。時(shí)能擴(kuò)增出條帶，0．01TCIDs。時(shí)條帶擴(kuò)增不出。用MDCK培養(yǎng)分離只能在1TCIDs。能觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)。 4．多重?zé)晒舛縍T一PCR反應(yīng)體系的特異性：流感病毒甲3／悉尼／5／97，甲1／北京／56／97，乙／深圳／12／97，甲3／浙江／78／00，甲3／浙江／52／04麻疹病毒滬191，風(fēng)疹病毒GOS株，流行性腮腺炎病

8、毒TeryLyn株，呼吸道合胞病毒Long株的RNA提取物作為模板分別加入多重?zé)晒舛縍T-PCR進(jìn)行測(cè)定，除流感病毒出現(xiàn)很好的陽性結(jié)果外，其它所有病毒的檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。 5．流感疑似患者臨床樣本的檢測(cè)對(duì)我市疑似流感暴發(fā)疫情及流感監(jiān)測(cè)醫(yī)院送檢的40份患者含漱液應(yīng)用多重?zé)晒舛縍T一PCR方法與病毒分離方法進(jìn)行檢測(cè)，其中病毒分離陽性8份(20％)，多重?zé)晒舛縍T一PCR陽性17份(42．5％)，這二者檢測(cè)的陽性患者結(jié)果一致。為

9、排除多重?zé)晒舛縍T一PCR假陽性，用血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雙份血清(急性期、恢復(fù)期)的血凝抑制效價(jià)，經(jīng)檢測(cè)診斷為流感近期感染。 結(jié)論 1．我們建立的多重?zé)晒舛縍T一PCR同時(shí)檢測(cè)甲型乙型流感病毒的方法是利用TaqMan技術(shù)是在普通PCR原有的一對(duì)特異性引物基礎(chǔ)上增加了一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針。利用該探針能與病原核酸特異性結(jié)合，而且結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域，探針的5’端和3’端分別標(biāo)記不同的熒光素，在PCR擴(kuò)增過程中，利用

10、檢測(cè)系統(tǒng)中熒光量的變化，通過檢測(cè)儀檢測(cè)并記錄的熒光信號(hào)的變化判定檢測(cè)結(jié)果。 2．檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià)：經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)毒株與臨床樣本的檢測(cè)比較，發(fā)現(xiàn)它不僅特異性高，而且比常規(guī)盯一PCR和病毒分離法更敏感，快速，也更簡(jiǎn)便。通常流感病毒的RT一PCR檢測(cè)敏感度在0．1TCID50左右，從病毒核酸提取，RT-PCR反應(yīng)與電泳，整個(gè)過程大約需6～7h左右。而采用本方法從核酸提取至完成檢測(cè)，僅需3h左右，敏感度可達(dá)0．001TCID50。 3．采