尼帕病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、尼帕病毒病 (Nipah Virus，NiV)是1999年新發(fā)現(xiàn)的一種烈性人畜共患病，可引起豬的呼吸道癥狀和人的急性致死性腦炎，首次發(fā)現(xiàn)于馬來(lái)西亞。NiV與1994年在澳大利亞首次發(fā)現(xiàn)的人畜共患病病毒——亨德拉病毒(Hendra Virus，HeV)極為相似。NiV與HeV均為副黏病毒科亨尼病毒屬成員，雖然只在局部地區(qū)暴發(fā)，但是它具有很寬的宿主范圍，對(duì)人的致死率達(dá)到40-70％，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。雖然我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)尼帕病，但該

2、病在我國(guó)鄰近國(guó)家，如孟加拉國(guó)、印度，頻頻發(fā)生，并且我國(guó)西南和華南一帶存在大量的此病毒儲(chǔ)存宿主——果蝠，因此此病毒對(duì)我國(guó)構(gòu)成了巨大威脅。為防范該病傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)，本研究建立了此病毒熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，以期快速檢測(cè)NiV，并用該方法檢測(cè)了一些臨床樣品。 根據(jù)GenBank中發(fā)表的馬來(lái)西亞、孟加拉國(guó)和印度等國(guó)報(bào)道的NiV的N基因序列，通過(guò)分析比較在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物和探針，分別對(duì)應(yīng)兩套檢測(cè)體系，篩選出靈敏性和特異性都比較好

3、的一套檢測(cè)體系。 針對(duì)類似檢測(cè)方法中RNA陽(yáng)性對(duì)照易降解等問(wèn)題，本研究設(shè)計(jì)并合成了選定體系的陽(yáng)性對(duì)照序列。該陽(yáng)性對(duì)照序列含有相應(yīng)引物的結(jié)合位點(diǎn)，但兩引物之間的陽(yáng)性對(duì)照的一些堿基被去除掉，人工合成此DNA序列后克隆到pBSK質(zhì)粒，構(gòu)成重組質(zhì)粒pBSK-NiV-P，用第一套引物擴(kuò)增，目的片段純化后克隆入pMD-18T載體，然后用上下游均含有T7啟動(dòng)子的PUC引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用T7轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物本質(zhì)上是d

4、sRNA，它經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋后，用作上述熒光RT-PCR 的陽(yáng)性對(duì)照。用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的dsRNA進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，并分別用DNase、RNase I消化等方法檢驗(yàn)其穩(wěn)定性，結(jié)果該陽(yáng)性對(duì)照OD<,260>/OD<,280>值在1.90～2.03之間，純度較高，經(jīng)37℃溫育24h和RNase I作用lh后僅有微量降解，說(shuō)明其性質(zhì)穩(wěn)定。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)一步優(yōu)化后，該方法還可以用于SYBR Green I模

5、式和普通RT-PCR檢測(cè)。對(duì)梯度稀釋的RNA和cDNA的檢測(cè)可知建立的熒光RT-PCR對(duì)RNA的檢測(cè)達(dá)到140拷貝/體系，對(duì)cDNA的檢測(cè)達(dá)到17拷貝/體系，敏感性比普通RT-PCR高100倍。從大腸桿菌、Vero細(xì)胞及豬各臟器中提取總RNA，用該熒光RT-PCR方法及陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果全為陰性，表明該方法特異性很好。其中有36份豬的臟器來(lái)自2005年四川鏈球菌疫區(qū)的病豬，為當(dāng)時(shí)疫病的準(zhǔn)確診斷提供了重要參考。 從海南采集3