尼帕病毒熒光RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、尼帕病毒病 (Nipah Virus，NiV)是1999年新發(fā)現(xiàn)的一種烈性人畜共患病，可引起豬的呼吸道癥狀和人的急性致死性腦炎，首次發(fā)現(xiàn)于馬來西亞。NiV與1994年在澳大利亞首次發(fā)現(xiàn)的人畜共患病病毒——亨德拉病毒(Hendra Virus，HeV)極為相似。NiV與HeV均為副黏病毒科亨尼病毒屬成員，雖然只在局部地區(qū)暴發(fā)，但是它具有很寬的宿主范圍，對人的致死率達到40-70％，已成為全球關注的公共衛(wèi)生問題。雖然我國尚未發(fā)現(xiàn)尼帕病，但該

2、病在我國鄰近國家，如孟加拉國、印度，頻頻發(fā)生，并且我國西南和華南一帶存在大量的此病毒儲存宿主——果蝠，因此此病毒對我國構成了巨大威脅。為防范該病傳入我國的風險，本研究建立了此病毒熒光RT-PCR檢測技術，以期快速檢測NiV，并用該方法檢測了一些臨床樣品。 根據GenBank中發(fā)表的馬來西亞、孟加拉國和印度等國報道的NiV的N基因序列，通過分析比較在其保守區(qū)域設計了兩對引物和探針，分別對應兩套檢測體系，篩選出靈敏性和特異性都比較好

3、的一套檢測體系。 針對類似檢測方法中RNA陽性對照易降解等問題，本研究設計并合成了選定體系的陽性對照序列。該陽性對照序列含有相應引物的結合位點，但兩引物之間的陽性對照的一些堿基被去除掉，人工合成此DNA序列后克隆到pBSK質粒，構成重組質粒pBSK-NiV-P，用第一套引物擴增，目的片段純化后克隆入pMD-18T載體，然后用上下游均含有T7啟動子的PUC引物擴增，擴增產物純化后用T7轉錄酶系統(tǒng)進行體外轉錄。體外轉錄產物本質上是d

4、sRNA，它經適當倍數(shù)的稀釋后，用作上述熒光RT-PCR 的陽性對照。用NanoDrop ND-1000分光光度計對體外轉錄的dsRNA進行濃度和純度測定，并分別用DNase、RNase I消化等方法檢驗其穩(wěn)定性，結果該陽性對照OD<,260>/OD<,280>值在1.90～2.03之間，純度較高，經37℃溫育24h和RNase I作用lh后僅有微量降解，說明其性質穩(wěn)定。對反應條件進一步優(yōu)化后，該方法還可以用于SYBR Green I模

5、式和普通RT-PCR檢測。對梯度稀釋的RNA和cDNA的檢測可知建立的熒光RT-PCR對RNA的檢測達到140拷貝/體系，對cDNA的檢測達到17拷貝/體系，敏感性比普通RT-PCR高100倍。從大腸桿菌、Vero細胞及豬各臟器中提取總RNA，用該熒光RT-PCR方法及陽性對照進行檢測，結果全為陰性，表明該方法特異性很好。其中有36份豬的臟器來自2005年四川鏈球菌疫區(qū)的病豬，為當時疫病的準確診斷提供了重要參考。 從海南采集3