新城疫病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)及RNA干涉.pdf

1、本研究的目的是建立檢測(cè)中強(qiáng)毒力雞新城疫病毒(NDV)的TaqmenRRT-PCR及檢測(cè)NDVNP基因的SYBRGreenⅠRRT-PCR；建立在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中開展RNAi研究平臺(tái)；利用該平臺(tái)評(píng)價(jià)自行設(shè)計(jì)的針對(duì)NDVNP基因的siRNA對(duì)NDV的干涉效果。CEF不僅適于多種易感病毒的分離培養(yǎng)，而且攜帶雞的全套基因組，這一平臺(tái)不僅適于篩選有效的siRNA分子，也可用于雞的功能基因研究。 1.檢測(cè)中強(qiáng)毒力NDV的Taqme

2、nRRT-PCR方法的建立。根據(jù)GenBank中發(fā)表的中、強(qiáng)毒力NDVF基因裂解位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)F基因位于248-397bp片段，長(zhǎng)度為149bp，覆蓋了F基因裂解位點(diǎn)；針對(duì)F基因裂解位點(diǎn)的Taqman探針長(zhǎng)24bp。經(jīng)過條件優(yōu)化和特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)，成功地建立了可快速檢測(cè)中、強(qiáng)毒力NDV的基于Taqman探針的RRT-PCR方法。該方法具有以下特點(diǎn)：(1)特異性強(qiáng)，對(duì)含有NDVⅠ系疫苗(中等毒力，基因Ⅰ型)、NDV標(biāo)

3、準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9(基因Ⅸ型)、雞源強(qiáng)毒分離株(基因Ⅶ型)和鴿源強(qiáng)毒分離株(基因Ⅵ型)的樣本有陽性擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)LaSota、Clone30、B1、V4等中國(guó)常用NDV弱疫苗毒株和傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒等非NDV病毒以及健康雞組織RNA無擴(kuò)增信號(hào)；對(duì)不同基因型(基因Ⅰ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ型)及不同來源(鴿源、雞源)的NDV中、強(qiáng)毒株均能檢出，上述基因型是目前我國(guó)流行株的主要基因型。對(duì)同一基因型毒力不同的毒株也可

4、以鑒別，NDVⅠ系疫苗株為基因Ⅰ型，是中等毒力毒株的代表，能被本研究建立的RRT-PCR檢出，而同為基因Ⅰ型的無毒株V4卻不出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)；(2)敏感度高，最小檢出量為60拷貝，10ELD50，0.01個(gè)血凝單位，較常規(guī)RT-PCR敏感10倍，對(duì)臨床樣本的檢出率明顯高于病毒雞胚分離法，從8個(gè)臨床樣本中均檢測(cè)出陽性擴(kuò)增信號(hào)(8/8)，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序證明均含有NDV強(qiáng)毒株F基因裂解位點(diǎn)，排除了假陽性的可能，而8份病料的雞胚分離率為5/8；(

5、3)檢測(cè)速度快，從病料處理到報(bào)告結(jié)果僅需4h；(4)重復(fù)性好，組內(nèi)異系數(shù)CV為2.35﹪～5.56﹪；穩(wěn)定性高，-20℃保存30d后重復(fù)檢測(cè)，組間變異系數(shù)CV為2.59﹪～6.59﹪；(5)通量高，1次可同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣本。該方法不僅可用于強(qiáng)毒NDV感染的快速診斷，還可用于ND監(jiān)測(cè)、v-NDV帶毒、排毒狀況的流行病學(xué)調(diào)查及檢疫等。 2.定量檢測(cè)NDVNP基因表達(dá)的SYBRGreenⅠRRT-PCR方法的建立。RRT-PCR定量檢

6、測(cè)核酸技術(shù)的方法有絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)煞N，絕對(duì)定量是用標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)未知樣本的精確拷貝數(shù)；而相對(duì)定量是通過選擇一個(gè)能在不同組織中穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參，與目的基因同時(shí)檢測(cè)，以確定(不同樣本中)目的基因表達(dá)量變化的方法。組織中的肌動(dòng)蛋白(β-actin)是細(xì)胞骨架成分，β-actin基因具有高度保守、在不同組織種表達(dá)豐度高且穩(wěn)定等特點(diǎn)，是最常使用的內(nèi)參基因。我們以DNA雙鏈結(jié)合熒光染料SYBRGreenⅠ作為檢測(cè)模式，建立了檢測(cè)NDVNP基

7、因的RRT-PCR方法，以β-actin作為內(nèi)參基因?qū)P基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)化，研究了NDVNP基因在雞胚成纖維細(xì)胞上的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)NP基因的表達(dá)量并不是隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，而是在感染后1h即接近峰值，隨后在12h內(nèi)大幅波動(dòng)，即在1、2、4、10h為波峰，3、5、6、12h為波谷，拷貝數(shù)銳減2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，推測(cè)這種變化可能與NP基因在病毒增殖過程中作為分子開關(guān)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與復(fù)制有關(guān)。該方法的建立也為評(píng)價(jià)RNAi干涉NDVNP

8、基因的效果提供了準(zhǔn)確的定量評(píng)價(jià)手段。 3.在雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行RNA干涉研究平臺(tái)的建立。目前還沒有在CEF中進(jìn)行RNAi的研究報(bào)道。我們選擇在CEF中建立RNA干涉研究平臺(tái)，比較了幾種不同的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性及轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化了siRNA的用量；研究了綠熒光蛋白(GFP)重組人腺病毒(Ade-GFP)對(duì)CEF和MDCK的感染性及增殖規(guī)律；以GFP基因?yàn)閳?bào)告基因，在CEF中建立了RNAi技術(shù)平臺(tái)，并與MDCK中的RNAi進(jìn)

9、行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNAiFectTM、SuperFect及Silent-fect3種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)CEF和MDCK均有一定的毒性，對(duì)CEF毒性尤甚，但CEF通過1次繼代培養(yǎng)后，對(duì)轉(zhuǎn)染試劑的耐受性大幅提高，幾乎達(dá)到MDCK的耐受性；Silent-fect對(duì)CEF毒性最輕微，故用于本研究的所有轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，其在CEF中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的效率為24.2﹪；當(dāng)重組腺病毒病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1～2000和0.01～2000時(shí)，Ade-GFP可分別

10、在CEF和MDCK中增殖并表達(dá)GFP，感染率為22.3﹪和52.0﹪，病毒增殖對(duì)細(xì)胞的活力及形態(tài)無明顯影響，說明Ade-GFP對(duì)CEF及MDCK雖具有較強(qiáng)的感染性，并可介導(dǎo)外源基因在細(xì)胞中高效表達(dá)，但對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育無明顯不良影響，證明其作為載體用于雞的基因治療有很大的潛力。以Ade-GFP介導(dǎo)的GFP基因?yàn)榘行蛄?，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人工合的靶向GFP的siRNA，成功地抑制了GFP基因在CEF及MDCK中的表達(dá)，建立了在CEF和MDCK

11、中進(jìn)行RNAi的技術(shù)平臺(tái)。 4.shRNA干涉NDV的增殖。siRNA是RNAi通路中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，可由多種途徑生成，早期主要使用化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄的siRNA，但因轉(zhuǎn)染的siRNA不穩(wěn)定，易被胞內(nèi)酶降解而發(fā)揮作用的時(shí)間較短，新近發(fā)展起來的siRNA載體表達(dá)技術(shù)，則可大大延長(zhǎng)RNAi效應(yīng)時(shí)間。其原理是模擬體內(nèi)dsRNA激活RNAi效應(yīng)過程，構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)表達(dá)短發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的RNA(shRNA)載體，shRNA可被細(xì)胞內(nèi)Dicer酶切

12、割成為21bp的siRNA。NDVNP基因位于NDV基因組3，端，編碼的NP蛋白不僅指導(dǎo)并參與NDV的組裝，還在病毒的基因組由轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)制模板時(shí)發(fā)揮分子開關(guān)作用，對(duì)NDV的復(fù)制與增殖具有重要作用。我們選擇NDVNP基因保守序列作為靶點(diǎn)，構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)表達(dá)shRNA的重組質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CEF，觀察其對(duì)NDV的干涉效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編碼靶向NP基因183位點(diǎn)的shRNA(ndv1)能有效抑制NP基因表達(dá)，在干涉后3h和9h，mRNA的表

13、達(dá)量分別下降了81﹪和50﹪，干涉后48h內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)上清液無血凝性，而陰性對(duì)照的病毒血凝價(jià)為8，證明ndv1完全阻斷了NDV在CEF中的增殖ndv1與106ELD50的NDV經(jīng)絨毛尿囊腔同時(shí)注入雞胚后17h，尿囊液中病毒減少62.5﹪，可將105ELD50的NDV接種雞胚尿囊液中病毒減少94.4﹪。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，自行設(shè)計(jì)的針對(duì)NDVNP基因的shRNA分子表達(dá)能大幅度敲低NP基因，有效抑制NDV的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步證明了NP基因與NDV的