五種柑橘病害的RT-PCR及多重RT-PCR檢測(cè)研究.pdf

1、本研究于2004年7月至2006年4月在廣東省農(nóng)科院果樹(shù)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，以柑桔衰退病、碎葉病、裂皮病、黃龍病和潰瘍病為研究對(duì)象，建立了分別檢測(cè)這五種病害的RT-PCR體系，并探討了多重RT-PCR檢測(cè)方法，以期獲得快速、準(zhǔn)確檢測(cè)柑桔病害的方法。獲得的主要研究結(jié)果如下： 1.建立了柑桔衰退病、碎葉病的RT-PCR檢測(cè)體系；并根據(jù)裂皮病為環(huán)狀類(lèi)病毒，GC含量達(dá)到59.5﹪，通過(guò)選用特異Taq酶和添加PCR增強(qiáng)劑來(lái)提高PCR擴(kuò)增

2、效率，建立了柑桔裂皮病的RT-PCR檢測(cè)體系。 2.首次RT-PCR檢測(cè)柑桔黃龍病和潰瘍病，并篩選出能在同一退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增的各病害特異引物，實(shí)現(xiàn)了五種病害的同步化檢測(cè)。 3.在柑桔黃龍病和衰退病RT-PCR檢測(cè)體系的基礎(chǔ)上，建立了同時(shí)檢測(cè)這兩種病害的二重RT-PCR檢測(cè)體系。得出適合二重PCR體系的Taq酶濃度為0.05U/μl；dNTPs濃度為0.25mmol/L；Mg2+為1.5mmol/L；兩引物的濃度為

3、HLB0.30μmol/L、CTV0.15μmol/L；退火溫度為63℃。 4.首次以oligo(dT)引物為反轉(zhuǎn)錄，運(yùn)用PCR檢測(cè)出具有ploy_(A)加尾的柑桔衰退病和碎葉?。话l(fā)現(xiàn)不具有ploy_(A)加尾的柑桔裂皮病同樣可以用oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄的RT-PCR檢測(cè)出，通過(guò)測(cè)序分析，其同源性在96﹪以上，并發(fā)現(xiàn)在CEV序列中有一個(gè)富含A的區(qū)段。在此基礎(chǔ)上結(jié)合二重RT-PCR體系，進(jìn)一步研究了同時(shí)檢測(cè)CTV、CEV和CTL