BVDV熒光RT-PCR檢測方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)是黃病毒科、瘟病毒屬成員，病毒粒子呈球形，有囊膜，核酸為長約12～13kb的單股正鏈RNA，根據(jù)能否使培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變將其分為兩種生物型：產(chǎn)細(xì)胞病變型和非細(xì)胞病變型.BVDV主要侵害牛、鹿和豬等動物，引起以腸道疾病、繁殖障礙、呼吸系統(tǒng)疾病、胎兒畸形和持續(xù)性感染。 BVDV的基因組包含5’-非編碼區(qū)(5'-NTR)、編碼一個大的聚合蛋白的開放閱讀框架

2、和3’-非編碼區(qū)(3’-NTR)。研究表明5'-NTR能形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，具有核糖體進(jìn)入位點，是BVDV的翻譯和復(fù)制的調(diào)控元件。由于BVDV5'-NTR的序列高度保守，所以常根據(jù)這一區(qū)域設(shè)計引物，進(jìn)行BVDV的檢測。 目前BVDV的檢測方法有病原分離、中和試驗、直接熒光抗體試驗、ELISA及核酸雜交技術(shù)、RT-PCR等多種方法，但血清學(xué)方法多存在費時、費力、準(zhǔn)確率低等缺點，而分子生物學(xué)的常規(guī)方法雖然在某些方面可以彌補，但假陽性

3、、環(huán)境污染、重復(fù)性不高等不足限制了推廣應(yīng)用， 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，實時定量熒光RT-PCR技術(shù)日益成熟，尤其是外標(biāo)實時定量熒光PCR被認(rèn)為是迄今為止最準(zhǔn)確、重復(fù)性最好的定量方法，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。因此為適應(yīng)進(jìn)出口檢疫的要求建立一種快速、靈敏、特異、重復(fù)性良好的檢測方法勢在必行。 試驗中應(yīng)用MDBK細(xì)胞培養(yǎng)牛病毒性腹瀉病毒標(biāo)準(zhǔn)株OregonC24V，72小時出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)：細(xì)胞變圓、細(xì)胞核

4、固縮到邊緣、胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡、脫落。在長有單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上依次加入10倍稀釋的OregonC24V0.1mL，記錄病變孔數(shù)及其出現(xiàn)的稀釋倍數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計算培養(yǎng)的OregonC24VTCID50=10-4.3。 以NADL、NewYork-1、Singer(Ia)、OregonC24V(Ib)、Draper(Ib)等參考BVDV毒株5’端非編碼區(qū)為參考序列，設(shè)計合成了實時定量熒光RT-PCR引物和

5、TaqMan熒光探針，設(shè)計目的片段大小94bp，TaqMan熒光探針5’端報告熒光為TAM，3’端淬滅熒光為TAMAR。初步設(shè)計反應(yīng)參數(shù)后體系參數(shù)優(yōu)化結(jié)果為：25mMMg2+5μL、5U/μLTaq酶0.5μL、20μM引物混合物1μL與20μM探針1.5μL，退火延伸溫度為60℃。進(jìn)一步進(jìn)行靈敏性、重復(fù)性、特異性試驗，結(jié)果本方法最低可檢測到0.1TCID50；特異性試驗中，BVDV陰、陽性對照成立，檢測豬瘟病毒、牛輪狀病毒、牛傳染性鼻

6、氣管炎病毒-1-為陰性。重復(fù)性試驗結(jié)果曲線重合性良好。 用建立的方法檢測四平達(dá)龍犢牛肛門拭子樣品30份、遼源金昌成年牛拭子樣品10、吉林萬隆成年牛拭子樣品15份、興隆山苗苗奶牛場犢牛拭子樣品20份、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場拭子樣品25份，檢測時每組樣品設(shè)立陰性、陽性對照。結(jié)果陽性，陰性對照成立，被檢樣品中成年牛10份，犢牛25份樣品呈陽性結(jié)果，犢牛陽性率高于成年牛15％。檢測死亡腹瀉犢牛腸及內(nèi)容物病料1份，結(jié)果陽性。 通過試驗