CSFV強弱毒鑒別和PRRSV快速檢測的TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立及應用.pdf

1、我國作為世界養(yǎng)豬大國，養(yǎng)豬業(yè)生產給我國帶來了很大的經濟效益，但是，豬病一直制約著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。近年來，豬病呈現(xiàn)出兩種及以上病原混合感染等現(xiàn)象，其導致的高發(fā)病率和高死亡率給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。在眾多豬病中，豬瘟（Classical swine fever，CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinerespiratory and reproductive syndrome，PRRS)仍然是目前嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)生產的兩大重要疾

2、病。
　　CSF是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種以高熱和出血為特征的高度接觸性傳染病。近年來，我國CSF的流行和發(fā)病特點發(fā)生了很大變化，以溫和型、非典型CSF和母豬帶毒綜合征為主，臨床表現(xiàn)也趨于復雜化。對于CSF的控制，我國主要采取疫苗免疫的措施，但疫苗免疫失敗的現(xiàn)象卻時有發(fā)生。CSF弱毒疫苗的大規(guī)模應用使得CSF野毒感染和疫苗接種的區(qū)分變得非常困難，因此，控制CSF流

3、行，防止CSF感染蔓延的前提是對CSF野毒感染和弱毒疫苗接種的情況作出準確、快速的鑒別診斷。
　　PRRS是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙和所有豬呼吸系統(tǒng)癥狀為典型特征的傳染病。PRRS是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病，世界各國對PRRS的研究一直都在進行，但至今該病仍未得到完全有效的控制。2006年，我國爆發(fā)了

4、高致病性PRRS，進一步加劇了PRRSV的復雜化，也給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經濟損失。對于PRRSV的感染，僅根據臨床癥狀和病理變化只能作出初步判斷，很難確診，因此，對PRRS快速、準確的診斷是控制PRRS流行的重要措施。
　　本文針對CSF和PRRS開展了以下方面的研究:
　　1.從GenBank中收集整理已經發(fā)布的54株CSFV毒株，經全基因組序列對比分析，在其5'NTR找到CSFV強毒和疫苗毒1個A堿基的差異性位點，根

5、據這一區(qū)域設計了2條MGB探針和1對特異性的通用引物，用于鑒別CSFV強毒和疫苗毒。通過矩陣法優(yōu)化反應體系和反應條件，建立了CSFV強弱毒鑒別的TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法，對該檢測方法進行特異性、敏感性和重復性試驗，并建立標準曲線，將該方法應用于臨床采集樣品的檢測，驗證其與普通RT-PCR方法的符合率。結果表明，該方法可特異性的鑒別CSFV強毒和疫苗毒，對豬源的其他病毒均無擴增;強毒和弱毒探針的敏感性分別達到101 c

6、opies/μL和102 copies/μL;該方法具有較好的重復性;通過臨床樣品檢測，與普通RT-PCR方法的符合率達到98.3％，具有較高的一致性。因此，該方法可用于臨床CSFV野毒感染和弱毒疫苗接種的鑒別檢測。
　　2.從GenBank中收集整理美洲型PRRSV經典毒株和目前國內主要流行毒株，經全基因組序列比較分析，在其保守區(qū)ORF6區(qū)域設計了美洲型PRRSV通用的引物和TaqMan探針，用于美洲型PRRSV準確快速的檢測。

7、通過優(yōu)化反應體系和條件，建立了PRRSV快速檢測的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，對該檢測方法進行特異性、敏感性和重復性試驗，并建立標準曲線，將該方法應用于臨床采集樣品的檢測，驗證其與普通RT-PCR方法的符合率。結果表明，該方法可特異性的檢測PRRSV，敏感性達到103 copies/μL，并且具有較好的重復性，通過臨床樣品檢測，與普通RT-PCR方法的符合率達到95.7％，具有較高的一致性。因此，該方法可用于臨床PRRSV準確