TGEV TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其S蛋白抗原位點(diǎn)的原核表達(dá).pdf

1、豬傳染性胃腸炎 (Porcine transmissible gastroenteritis,TGE) 是由豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmiss.ble gastroenteritis virus,TGEV) 引起的一種以一周齡以下仔豬嘔吐、水樣腹瀉和高死亡率(通常為100﹪)為主要特征的傳染病.該病是一種世界性的疾病,給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失.由于它主要引起一周齡以下仔豬幾乎100﹪死亡,所以及早的確診對(duì)該病的

2、防治就具有特別重要的意義,因此建立一種快速、高靈敏度的診斷方法對(duì)防治TGE是十分必要的.而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法都不能滿足特定要求,熒光定PCR技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題.本研究根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒N基岡和豬肌動(dòng)蛋白的基岡序列設(shè)計(jì)合成了引物和探針,RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因,并克隆到pMD18-T 載體得到剛性質(zhì)粒,用分光光度計(jì)對(duì)質(zhì)粒定量,10倍梯度稀釋即為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品.通過對(duì)熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了TaqMan熒光定量RT-

3、PCR檢測(cè) TGEV的方法.同時(shí)對(duì)60份現(xiàn)地病料進(jìn)行檢測(cè)并與常規(guī)RT-PCR方法、TGEV抗原快速檢測(cè)試劑盒(免疫層析法)比較.結(jié)果,該方法的檢測(cè)敏感性達(dá)到15拷貝/μl,且具有很好的特異性和重復(fù)性,而常規(guī)RT-PCR方法只能檢測(cè)到1.53×10<'3>拷貝/μl.對(duì)現(xiàn)地病料的檢測(cè)結(jié)果也表明該法比常規(guī)RT-PCR方法和TGEV抗原快速檢測(cè)試劑盒的敏感性高. 豬呼吸道冠狀病毒 (Poreine respiratory coron

4、avi rus,PRCV)是TGEV的基因缺失變異株,PRcV和TGEV核苷酸序列比較同源性達(dá)96﹪.由于TTGEV和PRCV基因組結(jié)構(gòu)十分相似,抗原有相關(guān)性,產(chǎn)生的中和抗體有交義反應(yīng),因此多克隆抗體等血清學(xué)方法很難將二者區(qū)分開.PRCV與TGEV相比,其S基因N末端有大量堿基缺失,不同的PRCV毒株其堿基缺失情況也各不相同,有621～681個(gè)堿基不等的缺失,并導(dǎo)致PRCV失去兩個(gè)抗原位點(diǎn).本研究根據(jù)已發(fā)表的PRCV基因組序列(GenB

5、ank登陸號(hào):DQ811787)中的S基因序列和本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的TGEV華毒弱毒株的s基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,用一對(duì)特異性引物對(duì)PRCV S基因缺失區(qū)域即TGEVS蛋白的 B 和 C 抗原位點(diǎn)(91～513nt)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增后的片段克隆到pET30a(+)表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá).SDS-PAGE結(jié)果表明,目的蛋白成功表達(dá),且蛋白表達(dá)量很高,占菌體總蛋白的45.4﹪.Western blot 分析結(jié)果表明目的蛋白具有很好的免疫學(xué)活性.本研究成