實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測AMACR mRNA的方法學(xué)建立及其臨床應(yīng)用.pdf

1、目的：采用Taqman-MGB探針技術(shù),建立實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)檢測AMACR mRNA的方法,對前列腺癌患者組織和尿液中AMACR mRNA進(jìn)行定量檢測并對其臨床應(yīng)用進(jìn)行評價(jià). 方法：1.根掘Genebank的AMACRmRNA序列,在AMACR基因的外顯了2和3之間設(shè)計(jì)一對引物和一條Taqman-MGB探針,優(yōu)化反應(yīng)體系,建立AMACRmRNA的FQ-RT-PCR方法.2.用pMD18-T載體

2、與普通PCR擴(kuò)增所得的AMACR cDNA片段進(jìn)行連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,將標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,以拷貝數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標(biāo),循環(huán)域值(Ct)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.3.對本方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià),包括該方法的靈敏性、特異性和重復(fù)性等.4.收集33例自訂列腺癌(PCa)組織,60例良性前列腺增生(BPH)組織和34例其他類型腫瘤組織(胃、甲狀腺、乳腺、卵巢、結(jié)腸、直腸等34例非前列腺組織),對這些組織中AMACR

3、mRNA含量進(jìn)行定量檢測,并分析其臨床意義;在前列腺穿刺活檢前共收集30例PCa和41例BPH患者前列腺按摩后的尿液,由于尿沉渣中不僅含有前列腺細(xì)胞,還含有尿道上皮細(xì)胞,而PSA mRNA在前列腺細(xì)胞中表達(dá)相對恒定,所以用PSA mRNA校正前列腺細(xì)胞數(shù),AMACRmRNA表達(dá)量/PSA mRNA表達(dá)量的比值表示尿液AMACR mRNA的含量,檢測尿液AMACR mRNA的含量并進(jìn)行臨床應(yīng)用評價(jià). 結(jié)果：1.成功建立了熒光定量逆

4、轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測AMACRmRNA的方法,本方法檢測靈敏度為5拷貝/反應(yīng),線性范圍為5～5×10<'8>拷貝/反應(yīng),Ct值與拷貝數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.998.批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1.68～2.30﹪和2.52～4.27﹪,重復(fù)性好.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析顯示本擴(kuò)增片段為AMACR特異性片段. 2.PCa組較BPH組及其他類型腫瘤組織AMACR的表達(dá)顯著增高(P值均<0.01),而BPH組和其它腫瘤組之間則無

5、顯著性差異(P>0.05).經(jīng)ROC曲線分析,AUC-ROC=0.893 (95﹪CI:0.816-0.970).前列腺組織中AMACR mRNA含量(AMACR mRNA/GAPDH mRNAx1000)截?cái)嘀禐?.05時(shí),靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、分別為81.8﹪、88.3﹪、86.0﹪、79.4﹪和89.8﹪.前列腺組織AMACR表達(dá)量與臨床分期和分化程度之間均無明顯相關(guān)性. 3.單獨(dú)測尿液AMACR

6、 mRNA含量與PCa無相關(guān)性,不能作為PCa診斷預(yù)測指標(biāo),以AMACR mRNA表達(dá)量/PSA mRNA表達(dá)量的比值表示尿液AMACR mRNA的含量,結(jié)果PCa組尿液AMACR mRNA的含量明顯高于BPH組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).ROC曲線分析結(jié)果顯示,AUC-ROC=0.763(95﹪CI:0.650～0.875),AMACR mRNA表達(dá)量/PSA mRNA表達(dá)量的比值以0.277為截?cái)嘀禃r(shí),其診斷PCa的總體靈

7、敏度和特異度分別為66.7﹪和75.6﹪.如果血清PSA以10ng/ml為臨界值,其總體特異度為48.7﹪(20/41),尿液AMACR mRNA較血清tPSA具有更高的特異性.此外,在血清PSA小于10ng/ml PCa患者5例中有3例尿液AMACR mRNA陽性,這提示尿液AMACR mRNA檢測可能有助于檢出低血清tPSA的PCa患者,其診斷效能不會因?yàn)镻SA水平降低受影響.不同臨床分期和病理分級之間尿液AMACR mRNA的含量

8、及表達(dá)陽性率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05). 結(jié)論： 1.熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測AMACR mRNA的方法具有靈敏、特異、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn). 2.PCa組織中AMACR mRNA特異性高表達(dá),為PCa診斷和監(jiān)測提供了理論依據(jù). 3.尿液AMACR mRNA用于PCa診斷較血清PSA有史高的特異性,能較好預(yù)測患者患PCa的風(fēng)險(xiǎn),可能有助于低血清PSA的PCa患者的檢出,而且具有無創(chuàng)傷性的優(yōu)勢