實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)臨床真菌方法的建立及其臨床應(yīng)用.pdf

1、目的：建立臨床病原真菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)其檢測(cè)臨床標(biāo)本真菌感染的應(yīng)用價(jià)值。 方法：酚-異硫酸氰胍法提取5例臨床培養(yǎng)陽(yáng)性病原真菌的DNA，利用與真菌核糖體的18SrDNA互補(bǔ)的一對(duì)通用引物，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)病原真菌的方法，應(yīng)用建立的提取真菌DNA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)了37例臨床標(biāo)本，通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)鑒定方法，評(píng)價(jià)其檢出真菌感染的有效性。 結(jié)果：通過(guò)酚-異硫酸氰胍法提取

2、的病原真菌DNA在純度和質(zhì)量上都符合PCR的實(shí)驗(yàn)要求，且整個(gè)提取過(guò)程經(jīng)優(yōu)化后在1小時(shí)內(nèi)完成；建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法擴(kuò)增曲線形態(tài)良好，無(wú)非特異性擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)到1.O，檢測(cè)靈敏度達(dá)到20pg DNA，5例臨床培養(yǎng)陽(yáng)性真菌菌株均能被檢出，且念珠菌和絲狀真菌具有不同的Tm值，據(jù)此可以初步鑒別。37例臨床標(biāo)本直接鏡檢共有9例陽(yáng)性，均為角膜標(biāo)本，普通培養(yǎng)法共培養(yǎng)到12例陽(yáng)性，包括鏡檢陽(yáng)性的9例角膜標(biāo)本，其余3例為深部真菌病患者組織，實(shí)