侵襲性曲霉菌感染實時熒光定量PCR檢測新技術的建立及臨床應用.pdf

1、研究背景 近年來，隨著器官移植和血液惡性腫瘤病人數(shù)量的不斷增多，免疫抑制劑的廣泛應用，重癥免疫低下患者數(shù)目呈幾何爆發(fā)趨勢。機會致病菌曲霉菌所致的感染發(fā)病不斷上升，已成為僅次于念珠菌感染的第二大深部真菌病。曲霉感染的病死率可達40％以上，晚期衰竭病人合并曲霉菌感染的病死率高達80％～100％，患者存活主要依賴于早期明確診斷和及時恰當?shù)目拐婢委?。而傳統(tǒng)的實驗室診斷包括真菌的培養(yǎng)、影像學診斷，不僅耗時較長，而且缺乏敏感性，所以探索一

2、種檢測曲霉菌快速可靠的方法已經(jīng)成為臨床實驗研究的熱點問題。 研究目的 在廣泛復習國內(nèi)外相關研究文獻的基礎上，通過自行設計引物、探針，建立簡捷、經(jīng)濟的提取曲霉菌DNA的方法。以期提供適合國內(nèi)臨床需要的快速診斷曲霉菌感染的Real-time PCR標準化方案，為臨床診斷提供參考。對收集的臨床高度疑似曲霉菌感染病人的血標本進行單盲檢測，評價其臨床診斷效能。把實時熒光定量PCR與臨床常用血清學方法檢測結果進行比較，得出結論。同時

3、探討抗真菌藥物對檢測結果的影響，找出最適合的檢測時機，提高檢測陽性率，指導臨床抽血檢驗。 研究方法 ①熒光定量PCR檢測方法的建立：在NCBI中的Genebank中查找相關菌屬及人類的18S rRNA、5.8S rRNA、28S：rRNA以及ITSⅠ、ITSⅡ基因序列。通過BLAST比對找出各菌屬間特異、曲霉菌屬內(nèi)保守的基因區(qū)間。通過ABI PrimerExpress 2.0軟件設計引物、探針。建立陽性克隆質(zhì)粒：在選定的

4、熒光探針靶基因的上下游設計引物，擴增片斷長度在200～300bp。用普通PCR在煙曲霉標準菌珠基因組中進行特異性擴增，純化產(chǎn)物，將此產(chǎn)物連接到pMD19-T vector中，得到重組克隆質(zhì)粒，送往測序。證實后用于制作實時熒光定量PCR的標準定量曲線及陽性對照。取標準曲霉菌菌株制成懸濁液，摸索最佳的曲霉菌DNA提取方法，并進行重復性試驗、最低檢測下限及方法特異性的實驗評價。②實時熒光定量PCR方法診斷效能的臨床評價：收集2006年4月至2

5、007年2月，廣州南方醫(yī)院高度疑似曲霉菌感染病例71例，標本232份。分成5批檢測，每批隨機抽得標本，編號，用熒光定量PCR單盲檢測，后與臨床病人信息核對，評價該方法的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值及陰性預測值。同時用X<'2>檢驗(McNcmar檢驗)與臨床常用血清學方法一曲霉菌抗原(ELISA)檢測進行對比。通過分析抗真菌藥物使用前后患者檢測結果的改變，找出抗真菌藥物對熒光定量PCR檢測結果影響的規(guī)律，以及其檢測結果對病人預后的

6、提示作用。 研究結果 ①熒光定量PCR檢測方法的建立：成功建立熒光定量PCR檢測侵襲性曲霉菌感染的方法。針對曲霉菌rDNA基因的轉錄間隔區(qū)ITS Ⅰ設計引物、探針。擴增片段長79bp。對構建好的克隆質(zhì)粒測序，插入片段與預期片段序列一致，相似性達99％。陽性克隆倍比稀釋制作熒光定量PCR的定量標準曲線： Y=-0.37X+16.05，R<'2>=0.997。熒光定量PCR的重復性好，平均試驗內(nèi)變異系數(shù)分別為1.89％、1.

7、56％、2.57％。平均試驗間變異系數(shù)為3.32％、3.58％、4.50％。該方法最低檢測下限達5～10CFU/ml，對白色念珠菌、隱球菌、毛霉菌、根霉菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢測結果均為陰性，無非特異性擴增。 ②實時熒光定量PCR方法診斷效能的臨床評價：71個病例中確診10例，臨床診斷30例，擬診8例，非曲霉菌感染病例23例。232份標本中熒光定量PCR檢測陽性率為42.2％(98/232)。該方法的敏感度為80％～

8、87.5％，特異度為95.6％(22/23)，準確度為90.1％～90.7％。陽性預測值為88.8％～97.6％，陰性預測值為75.8％～91.7％；與曲霉菌抗原檢測比較，兩者的敏感度無統(tǒng)計學差別(P=0.549(雙側)，P>0.05)；兩者特異度比較中，P=0.021(雙側)，P<0.05，特異度差異有顯著性意義，熒光定量PCR的特異度較高。③抗真菌治療對熒光定量PCR方法的影響及意義：臨床上抗真菌治療對熒光定量PCR檢測結果有較大影

9、響。臨床經(jīng)驗性抗真菌藥物的使用可使熒光定量PCR結果呈現(xiàn)假陰性。研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性曲霉菌感染病人經(jīng)藥物治療后，約60％～70％病人血標本熒光定量PCR檢測結果轉為陰性。為提高檢出率，早日明確診斷，故建議在病人未使用藥物治療之前抽血送檢。此外，一些曲霉菌感染的病人在停用抗真菌藥物之后，有很大的復發(fā)可能，在治療前后，連續(xù)動態(tài)監(jiān)測病人血中曲霉菌DNA是必要的。熒光定量PCR結果持續(xù)陽性，往往提示病人預后很差，病死率較高(6/8)。 研究

10、結論 ①成功建立侵襲性曲霉菌感染熒光定量PCR檢測新技術：自主設計的檢測曲霉菌特異性的引物探針，達到了國外相關研究的水平，有較高的敏感度、特異度。同時，建立了適合臨床實驗室采用的簡單、快速、經(jīng)濟的提取曲霉菌DNA的方法。構建了含有目的擴增片斷的陽性質(zhì)粒做為陽性對照，為產(chǎn)品形成試劑盒打下基礎。 ②完成侵襲性曲霉菌感染熒光定量PCR檢測新技術的臨床效能評價：檢測臨床高度疑似曲霉菌感染病人血清，有較高的準確度及陽性預測值。該方

11、法對重癥免疫低下患者曲霉菌感染的早期診斷有很大的提示作用。與血清學方法相比，熒光定量PCR檢測結果具有更客觀可靠、易于判斷等優(yōu)點。該項技術有待進一步標準化，為今后國內(nèi)同類研究提供一定的參考依據(jù)。它的較廣闊的臨床應用前景，有望早日投入市場，為廣大患者服務。 課題的創(chuàng)新之處(1)通過特異性引物、探針的設計，建立具有自主知識產(chǎn)權的曲霉菌熒光定量PCR檢測新技術。 (2)建立適合臨床實驗室采用的提取曲霉菌DNA方法。 (