肺炎克雷伯菌熒光定量PCR檢測方法的建立和臨床應用.pdf

1、研究背景:
　　肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn）屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，最早由Friediander于1893年從大葉性肺炎患者的肺組織中首次分離到。克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，無鞭毛，無芽孢，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上可形成莢膜。多數(shù)菌株有菌毛，具有菌體抗原、莢膜抗原、菌毛抗原等多種主要抗原成分。該菌為兼性厭氧菌，營養(yǎng)要求不高，在培養(yǎng)基上可形成較大、凸起、灰白色粘液型的菌落。
　　典型的肺炎克雷伯菌

2、是一種條件致病菌，它能使免疫力低的人群易獲得醫(yī)院感染。該菌在正常人口咽部的帶菌率為1％-6％，但在住院病人中可高達20％，是糖尿病病人和慢性阻塞性肺病患者并發(fā)肺部感染的潛在危險因素[1]。近年來，由于這些典型的肺炎克雷伯菌株出現(xiàn)了耐藥情況，且呈上升趨勢，使得該菌在臨床治療上極為棘手。最近有報道稱，一種新的高毒性的肺炎克雷伯菌變種已經(jīng)出現(xiàn)，它的臨床特征為能在年輕的健康人群中引發(fā)嚴重的、威脅生命的社區(qū)獲得性感染。這些感染包括肝膿腫、肺炎、腦

3、膜炎、感染性眼內(nèi)炎和轉(zhuǎn)移性葡萄膜炎。如果這些菌株也出現(xiàn)了耐藥趨勢，那么臨床治療將會面臨巨大的挑戰(zhàn)[2,3]。因此，臨床迫切需要一種快速，準確和簡便的方法來鑒定出病原菌，以輔助臨床選擇有效的抗生素來減少致死率和耐藥菌株的出現(xiàn)[3-5]。
　　細菌培養(yǎng)鑒定是目前常用的檢測肺炎克雷伯菌的方法，一般需要經(jīng)過分離培養(yǎng)，生化反應鑒定，血清學鑒定，腸毒素測定等步驟。盡管臨床上已有半自動和全自動微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)（例如Vitek系統(tǒng)），但整個培

4、養(yǎng)鑒定過程至少需要48-72小時，耗時耗力，不能滿足目前臨床快速診斷的要求。實時熒光定量PCR技術(shù)是目前常用的分子診斷技術(shù)，與常規(guī)細菌培養(yǎng)法比較，它具有特異性強、重復性好、定量準確、大批量檢測、自動化程度高等優(yōu)點[6，7]。本研究旨在建立檢測肺炎克雷伯菌的熒光定量PCR方法，對其敏感性、特異性等進行評價，并應用此方法對臨床疑似肺炎克雷伯菌感染的患者的痰液標本進行檢測，為其臨床應用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1建立實時熒光定量

5、PCR檢測肺炎克雷伯菌的方法，通過檢測不同濃度梯度的肺炎克雷伯菌標準株(ATCC700603)，15種非肺炎克雷伯菌及重復檢測低、中、高三個濃度的肺炎克雷伯菌標準株(ATCC700603)來評價其線性、敏感性、特異性及精密度。
　　2收集2014年3月至7月期間浙江大學附屬第一醫(yī)院疑似肺炎克雷伯菌感染住院病人255例痰液標本。用建立的實時熒光定量PCR法檢測標本，與細菌培養(yǎng)法比較，分析敏感性和特異性。
　　結(jié)果:
　　

6、1已建立的實時熒光定量PCR法在肺炎克雷伯菌濃度103-107 copies/ml范圍內(nèi)有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)為0.998。
　　2實時熒光定量PCR法的最低檢測限為1×103copies/ml。
　　3本方法檢測其它常見致病菌（金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、大腸埃希桿菌等）均為陰性，無交叉反應，證實有較好的特異性。
　　4實時熒光定量PCR法對低、中、高三個濃度標準品重復檢測的結(jié)果如下:

7、低濃度三次批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.05％、1.17％、1.11％，批間變異系數(shù)為1.26％;中濃度三次批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.23％、2.84％、1.66％，批間變異系數(shù)為1.97％;高濃度三次批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.01％、1.15％、1.25％，批間變異系數(shù)為1.28％。
　　5實時熒光定量PCR法檢測255例臨床痰標本中，檢測出82例肺炎克雷伯菌陽性（陽性檢出率為32.16％，），細菌培養(yǎng)鑒定出69例陽性(陽性檢出率為27.06％