沙門氏菌熒光PCR快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、該研究采用分子信標(biāo)技術(shù)和TaqMan-MGB技術(shù),建立了兩種針對(duì)沙門氏菌的特異性熒光PCR檢測(cè)方法,并初步運(yùn)用于臨床診斷和食品污染調(diào)查.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.沙門氏菌熒光PCR檢測(cè)體系的建立(1)研究6種增菌液對(duì)熒光PCR反應(yīng)的影響,選擇SC(亞硒酸鹽胱氨酸)增菌液為最佳培養(yǎng)沙門氏菌的增菌液.建立快速簡(jiǎn)便的樣品前處理方法.(2)根據(jù)沙門氏菌屬特異性基因invA設(shè)計(jì)了四對(duì)引物,并和Rahn設(shè)計(jì)的引物同時(shí)檢測(cè)大量沙門氏菌及非沙門氏菌菌株,選用了

2、其中一對(duì)特異性最強(qiáng)的新引物.(3)在這對(duì)引物間選擇一段寡核苷酸序列,兩端分別用FAM和MGB標(biāo)記,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立沙門氏菌TaqMan-MGB檢測(cè)方法.(4)在這對(duì)引物間選擇另一段寡核苷酸序列,兩端各加上6bp互補(bǔ)的寡核苷酸形成分子信標(biāo),優(yōu)化反應(yīng)條件,建立沙門氏菌分子信標(biāo)檢測(cè)方法.2.沙門氏菌熒光PCR檢測(cè)體系的評(píng)價(jià)(1)特異性:用這兩種熒光PCR方法分別檢測(cè)200株沙門氏菌屬菌株,均呈陽(yáng)性;檢測(cè)200株非沙門氏菌屬菌株,均呈陰性.(

3、2)靈敏度:以鼠傷寒沙門氏菌為實(shí)驗(yàn)菌株(40循環(huán)).對(duì)于DNA抽提物,TaqMan-MGB方法的檢出限為69fg/PCR體系,分子信標(biāo)方法的檢出限為346fg/PCR體系;對(duì)于菌液,TaqMan-MGB方法和分子信標(biāo)方法的檢出限均為2cfu/PCR體系;對(duì)于食品樣品,TaqMan-MGB方法和分子信標(biāo)方法的檢出限均為2cfu/25g樣品.(3)抗干擾性:反應(yīng)不受其他雜菌的干擾,食品樣品經(jīng)處理后對(duì)反應(yīng)無(wú)影響.(4)重復(fù)性:平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一

4、致性高,可重復(fù)性強(qiáng).3.沙門氏菌熒光PCR檢測(cè)體系的應(yīng)用(1)對(duì)深圳市肉菜市場(chǎng)的生肉、熟食進(jìn)行抽查,200份生肉樣品中,熒光PCR方法和傳統(tǒng)方法均為陽(yáng)性的為32份,熒光PCR陽(yáng)性而傳統(tǒng)方法陰性的為33份.(2)對(duì)食品從業(yè)人員的肛拭子調(diào)查中,300份樣品用熒光PCR方法和傳統(tǒng)方法均有3份檢出陽(yáng)性,符合率100﹪.(3)細(xì)菌性食物中毒的快速診斷:45份樣品用熒光PCR方法和傳統(tǒng)方法均檢出28份沙門氏菌陽(yáng)性,符合率100﹪.該研究在國(guó)內(nèi)首次建