食源性沙門氏菌的PCR快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、沙門氏菌是一種廣泛分布于自然界的危害極大的腸道致病菌，人們會(huì)因?yàn)橹苯咏佑|或食用被污染的食物而感染，并導(dǎo)致腹瀉或系統(tǒng)性疾病，在世界各國(guó)的各類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常居榜首。目前，檢測(cè)方法在控制食物污染和傳播方面仍占有重要地位，然而現(xiàn)有的檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)或者檢測(cè)靈敏度較低等不能滿足及時(shí)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)食品中微生物安全性的需求，因此，有必要建立快速靈敏的檢測(cè)方法為保障食品安全提供有效的檢測(cè)工具。本研究通過優(yōu)化建立了以DNA為基礎(chǔ)的熒

2、光定量PCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行特異性、靈敏度、重復(fù)性等檢測(cè)以及食品添加實(shí)驗(yàn)分析方法的適用性和可靠性。同時(shí)，研究了不同熱處理對(duì)沙門氏菌DNA降解的影響，以及死亡菌體對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的影響。最后優(yōu)化建立了基于區(qū)分死活菌體的逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)條件，并驗(yàn)證死亡菌體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。
　　 研究結(jié)果表明：(1)優(yōu)化后的熒光定量PCR檢測(cè)條件為：95℃/30 s；然后95℃/5 s，64℃/34 s，此步驟為40個(gè)循環(huán)；最后添加

3、融解曲線分析。反應(yīng)體系總量為20μl，其中上下游引物(1μM)的添加量為2μl。建立的熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)，重復(fù)性良好，靈敏度高而且不需要前增菌大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程可在4 h內(nèi)完成。將此方法應(yīng)用于人工污染食品中沙門氏菌的檢測(cè)，結(jié)果表明生鮮豬肉、調(diào)理雞肉和鮮牛奶樣品中沙門氏菌的檢測(cè)靈敏度分別為1.9×102cfu/g、4.5×102cfu/g和1.5×102cfu/ml。通過與微生物傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)

4、果顯示不論在定性還是定量方面與傳統(tǒng)方法的符合率為100％，可用于食品中沙門氏菌的定量檢測(cè)。(2)食品加工和消費(fèi)中常見的熱處理65℃/20 min、85℃/30 min、沸水浴/3 min和121℃/15 min能完全殺死菌液中沙門氏菌：加熱溫度越高對(duì)基因組DNA的破壞性越大，但是加熱并不能使細(xì)菌DNA完全降解消亡，經(jīng)不同溫度和時(shí)間加熱處理后，目的基因片段仍不同程度地殘存在死亡的細(xì)胞當(dāng)中，并且消亡速度非常緩慢。(3)熱致死沙門氏菌中殘存的

5、基因組DNA或DNA片段對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果影響較大，對(duì)人體健康沒有威脅的死亡菌體樣品經(jīng)檢測(cè)結(jié)果為陽性，表明以DNA為基礎(chǔ)的熒光定量PCR不能有效地區(qū)別死活菌，此方法并不適用于含有熱致死菌體的樣品例如加工肉制品、即食食品中沙門氏菌的檢測(cè)，而較適用于生鮮食品的檢測(cè)。(4)優(yōu)化后的逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR反應(yīng)條件為：42℃/5 min，95℃/5 s；然后95℃/5 s，67℃/34 s，此步驟為40個(gè)循環(huán)；最后添加融解曲線分析。反應(yīng)體系總

6、量為25μl，其中上下游引物(1μM)添加量分別為4μl。建立的逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR不需前增菌處理，整個(gè)檢測(cè)過程在4h內(nèi)即可完成，明顯地縮短了檢測(cè)時(shí)間。另外，生鮮豬肉、調(diào)理雞肉和鮮牛奶樣品中沙門氏菌的靈敏度分別為1.9×102cfu/g、4.5×103cfu/g和1.5×103cfu/ml比熒光定量PCR的靈敏度低。比較該方法與熒光定量PCR的定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，定量檢測(cè)不如熒光定量PCR，但是它的最大優(yōu)點(diǎn)是可以區(qū)分死活菌彌補(bǔ)了熒光定量PCR