FTA濾膜用于PCR檢測肉中的沙門氏菌.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來食品安全問題的一個顯著特點(diǎn)，沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動物的繁殖生產(chǎn)力。為確保食品安全與食品貿(mào)易，需要大力加強(qiáng)食品檢驗(yàn)的力度，迫切需要建立快速、靈敏的沙門氏菌的檢驗(yàn)方法。
　　 本研究以沙門氏菌的i

2、nvA基因?yàn)榘谢?，選擇特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測肉中沙門氏菌。對PCR反應(yīng)體系中鎂離子濃度、引物添加量及退火溫度和循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確定適宜的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，其適宜反應(yīng)體系為：6μL 10×PCR buffer,4 μL dNTPs混合物，5.0μL Mg2+(25mM),2 μL 10 μmol正向引物,2 μL 10 μmol反向引物，0.25 μL（5 U/μL）Taq,20.75 μL水，總反應(yīng)體系為50μL；

3、其適宜的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)采用冷啟動，94℃預(yù)變性5 min；變性94℃ 1 min～退火58℃ 0.5 min進(jìn)行35個循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列與文獻(xiàn)報(bào)道的靶基因序列的同源性達(dá)100％，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。本研究共檢測了16株菌，以驗(yàn)證引物的特異性，結(jié)果表明：4株沙門氏菌均為陽性結(jié)果；12株其它非沙門氏菌菌株均為陰性結(jié)

4、果。因此該引物特異性強(qiáng)，可用于檢測沙門氏菌。
　　 利用FTA濾膜,采用PCR技術(shù)可直接檢測肉及肉制品中的沙門氏菌,無需增菌，靈敏度高。在采用浮選與溶劑萃取相結(jié)合方法的基礎(chǔ)上，使用FTA膜可高效地從鮮肉中提取沙門氏菌的DNA，消除PCR反應(yīng)的抑制因子。以沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的invA基因?yàn)榘谢?，?jīng)過PCR擴(kuò)增得到376bp的產(chǎn)物。經(jīng)過DNA測序證實(shí)該產(chǎn)物為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。使用FTA濾膜處理樣品，再通過PCR方法

5、檢測沙門氏菌，豬肉、牛肉、羊肉、雞肉勻漿液的檢出限均為101cfu/mL，可在6h內(nèi)完成對肉中沙門氏菌的檢測，比目前普遍采用的先增菌再進(jìn)行PCR檢測的方法縮短了12～24h。實(shí)際檢測了72份樣品，同時(shí)與GB/T4789.4-2003方法做比較，PCR方法的檢出率為27.8％，檢出時(shí)間為6h，GB/T4789.4-2003方法檢出率為22.2％，檢出時(shí)間為5d，結(jié)果表明FTA濾膜用于PCR檢測肉中沙門氏菌檢出率高，耗時(shí)短。使用FTA濾膜法