疊氮溴化乙錠(EMA)聯(lián)用PCR方法應(yīng)用于雞肉中沙門氏菌活菌檢測(cè)研究.pdf

1、疊氮溴化乙錠(EMA)是一種核酸熒光染料，它具有與細(xì)胞外DNA、死亡細(xì)胞DNA或細(xì)胞膜受損細(xì)胞的DNA共價(jià)結(jié)合并抑制其發(fā)生PCR擴(kuò)增反應(yīng)，而對(duì)活菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增不產(chǎn)生影響的特點(diǎn)。因此將EMA與PCR技術(shù)相結(jié)合，可克服直接PCR方法無法區(qū)分死活菌的缺點(diǎn)，并避免假陽性試驗(yàn)結(jié)果。EMA與PCR技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)已用于多種致病菌的檢驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)添加一定量的EMA不會(huì)對(duì)副溶血弧菌、腸彎曲桿菌、結(jié)合酵母、黏質(zhì)沙雷氏菌等細(xì)菌的DNA擴(kuò)增產(chǎn)生抑制作用，但

2、會(huì)造成大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、藤黃微球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌等細(xì)菌基因組DNA提取量不同程度的損失。此外，EMA是否會(huì)影響腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌活菌的DNA擴(kuò)增未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究將EMA應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌的檢測(cè)，探索EMA對(duì)腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌活菌DNA擴(kuò)增的影響情況，建立一種只檢測(cè)沙門氏菌活菌的方法。具體研究?jī)?nèi)容和試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.腸炎沙門氏菌EMA PCR檢測(cè)

3、方法的建立
　　本部分首先探討了EMA對(duì)腸炎沙門氏菌DNA擴(kuò)增的影響情況，然后用于死/活混合菌液的檢測(cè)，以建立EMA PCR檢測(cè)方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn):添加EMA至終濃度為50μg/mL、曝光時(shí)間為10 min時(shí)，可抑制濃度為2.75×107 CFU/mL的腸炎沙門氏菌死菌的DNA擴(kuò)增，且不會(huì)影響PCR方法檢測(cè)腸炎沙門氏菌活菌的靈敏度，可有效避免假陽性試驗(yàn)結(jié)果。
　　2.雞肉中活的鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的EMA RT-PCR檢

4、測(cè)方法的建立
　　本部分使用EMA與RT-PCR聯(lián)用的方法研究EMA處理對(duì)目標(biāo)菌PCR反應(yīng)的影響情況，然后將建立的EMA RT-PCR方法用于雞肉中沙門氏菌的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):活菌添加EMA至終濃度為50μg/mL時(shí)，其Ct值與未經(jīng)EMA處理組的Ct值無顯著性差異(P＞0.05)，死菌經(jīng)EMA處理后其Ct值與活菌經(jīng)EMA處理后的Ct值有顯著性差異(P＜0.05)，而與陰性對(duì)照組無顯著性差異(P＞0.05)，表明添加EMA不會(huì)影響活菌

5、的DNA擴(kuò)增。使用鼠傷寒沙門氏菌特異性引物建立的EMA RT-PCR方法用于雞肉中鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與直接RT-PCR方法相比，EMA RT-PCR方法的檢測(cè)結(jié)果更接近與平板計(jì)數(shù)結(jié)果(P＞0.05)。相應(yīng)地，使用腸炎沙門氏菌特異性引物建立的EMA RT-PCR方法用于雞肉中腸炎沙門氏菌的檢測(cè)其試驗(yàn)結(jié)果也與平板計(jì)數(shù)結(jié)果無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.雞肉中混合沙門氏菌EMA RT-PCR檢測(cè)方法的建立
　　本部

6、分首先建立了沙門氏菌屬通用引物建立了沙門氏菌的EMA RT-PCR檢測(cè)方法，然后將其與第二部分建立的兩種方法同時(shí)應(yīng)用于雞肉中混合沙門氏菌的檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)只添加一種引物進(jìn)行RT-PCR時(shí)，使用通用引物建立的沙門氏菌EMA RT-PCR方法可以較準(zhǔn)確地檢出樣品中活的沙門氏菌，其檢測(cè)結(jié)果與與平板計(jì)數(shù)結(jié)果差異不顯著(P＞0.05);使用鼠傷寒沙門氏菌特異性引物、腸炎沙門氏菌特異性引物分別建立的EMA RT-PCR方法，其對(duì)混合樣品中鼠傷寒沙