雞白痢沙門氏菌常規(guī)和實時熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起的危害養(yǎng)禽業(yè)的細菌病之一，嚴重影響著我國禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并且被列為國家規(guī)定凈化的細菌病。目前，最有效的防控措施是加強對雞群的檢疫、及時淘汰感染雞只，逐步達到凈化雞群的目的。因此，建立一種快速、準確的檢測方法對于雞白痢的凈化工作有著重要意義。
　　本研究中，通過對GenBank登錄的菌株號為ATCC9120的雞白痢沙門氏菌全基因組進行全面生物信息學分析，與NCBI數據庫中其他菌屬的基因組比較，篩選出了

2、雞白痢沙門氏菌基因組中的一段基因號為SEEP9120_017695的保守序列，該基因為雞自痢沙門氏菌的特有基因，因此確定其為檢測雞白痢沙門氏菌的靶基因。根據選出的靶點基因設計了11對候選引物，使用33株沙門氏菌和11株非沙門氏菌以PCR方法分別驗證各對引物的特異性，最終篩選出了一對特異性最好且擴增條帶大小(219 bp)適合進行熒光定量PCR的引物，經PCR條件優(yōu)化后建立了一種常規(guī)PCR檢測方法。對所建立方法的靈敏度進行檢驗，其檢測雞白

3、痢沙門氏菌基因組時，靈敏度可達2.13 pg/μL;檢測細菌純培養(yǎng)物時靈敏度為2.1×104 cfu/mL。以該方法對人工污染雞白痢沙門氏菌的雞糞、雞蛋和雞肉進行檢測，對于輕度污染(13 cfu/10g樣品)的樣品，只需要對樣品增菌培養(yǎng)6～8小時便可檢出;增菌培養(yǎng)2h便可檢測嚴重污染（1.3×107 cfu/10g樣品）的樣品。但是在檢測雞蛋樣品時需適當增加1～2小時的增菌時間便可有效檢出陽性樣品。
　　根據常規(guī)PCR方法的反應條

4、件，建立了SYBR熒光定量PCR方法。依據特異性評價實驗結果中44個菌株的擴增曲線和熔解曲線，分析可知該方法檢測雞白痢沙門氏菌時的特異性好。建立的SYBR熒光定量PCR方法檢測雞白痢沙門氏菌基因組的靈敏度為34 fg/μL。使用雞白痢沙門氏菌分別污染雞糞、雞蛋、雞肉，建立人工污染樣品，同時使用本研究建立的SYBR熒光定量PCR方法和標準細菌分離鑒定的方法對污染樣品進行檢測，評價本方法的檢測效果。當雞白痢沙門氏菌的初始污染量低至2 cfu

5、/10 g雞糞或雞肉時，經過6h對樣品的振蕩培養(yǎng)，熒光定量PCR方法陽性檢出率為24/27(88.9％)，與標準方法檢測的符合率為100％;當以2 cfu/10 mL的初始接種量污染雞蛋時，6h后熒光定量PCR方法的陽性檢出率為21/27(77.8％)，與標準方法檢測的符合率為91.7％。
　　本研究篩選到一個雞白痢沙門氏菌特有的基因作為檢測用的靶基因，并以此建立了常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR檢測方法，兩種方法在實際檢測中各有優(yōu)