沙門氏菌特異性靶點的篩選及熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、本研究利用生物信息學(xué)手段,通過比對沙門氏菌及其他原核生物的基因組序列,發(fā)掘出361段沙門氏菌特異性片段作為候選分子檢測靶點。從這些序列中隨機(jī)挑選出30個序列片段,設(shè)計普通PCR引物,并用58株沙門氏菌菌株和22株非沙門氏菌菌株對每對引物的檢測特異性進(jìn)行評價,篩選出15對特異性較好的引物。經(jīng)進(jìn)一步靈敏度評價,得到6對檢測靈敏度較好的引物,分別為:c1(36.5fg/PCR,500 cfu/mL);c3(36.5fg/PCR,500 cfu

2、/mL);c20(36.5fg/PCR,500cfu/mL);c23(36.5fg/PCR,5×104cfu/mL);c24(36.5fg/PCR,500cfu/mL)和plc(36.5fg/PCR,500cfu/mL)。用鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14028)人為污染牛奶樣品后,用建立好的普通PCR方法進(jìn)行檢測驗證,當(dāng)初始接種菌量為8 cfu/25g牛奶時,引物c3,c20,c24和plc均能在增菌6-8小時內(nèi)檢出陽性結(jié)果;而嚴(yán)重污染的

3、牛奶樣品(＞104cfu/25g牛奶)則只需增菌2-4小時即可檢出沙門氏菌。在普通PCR方法的基礎(chǔ)上,挑選出一段特異性較好的沙門氏菌基因組片段,設(shè)計出MGB-TaqMan探針p4以及相應(yīng)的引物。同時,利用DNA隨機(jī)重組技術(shù)構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)探針,合成單鏈寡核苷酸直接作為內(nèi)標(biāo)模板,以指示由PCR抑制劑等因素引起的假陰性結(jié)果,建立沙門氏菌實時熒光PCR檢測方法,并對其特異性、靈敏度、抗干擾性以及在食品樣品中的實際檢測能力進(jìn)行評價。經(jīng)40株沙門氏菌

4、和24株非沙門氏菌檢測驗證,熒光定量PCR具有良好的特異性,以腸炎沙門氏菌(CDC H3526)基因組DNA作為模板,檢測靈敏度達(dá)到18.6fg/PCR;以鼠傷寒沙門氏菌(CDC G7601)基因組DNA作模版,PCR反應(yīng)檢測靈敏度為40.2fg/PCR。在雞肉樣品中自然存在背景菌群的干擾下,PCR檢測限為130cfu/mL,且PCR定量結(jié)果與實際接入的沙門氏菌量處于相同或相近水平。用所建立的熒光定量PCR方法檢測人工污染至雞肉樣品中的