熒光假單胞菌PCR檢測靶點的篩選及PCR檢測體系的建立.pdf

1、熒光假單胞菌（Pseudomonas Fluorescens）是一種嗜冷微生物，在冷藏的生肉、生牛乳等高蛋白高脂肪的食品中是導(dǎo)致腐敗的優(yōu)勢菌種。免疫缺陷病患者被熒光假單胞菌感染血液，可能導(dǎo)致敗血癥等嚴重后果，屬于典型的“條件致病菌”。隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的變化，熒光假單胞菌對人類健康的潛在威脅日益擴大。建立快速、準確的熒光假單胞菌檢測方法對完善食品安全監(jiān)測體制有重要的意義。
　　PCR技術(shù)因其具有特異性強，靈敏度高，反

2、應(yīng)快速等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用在食源性致病微生物的檢測領(lǐng)域。針對熒光假單胞菌的PCR檢測仍處于初級階段。目前檢測熒光假單胞菌的種特異性基因靶點很少，且缺乏系統(tǒng)評價。本研究將通過生物信息學(xué)手段，尋找新的種特異性的檢測靶點，針對這些靶點以及16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列與gyrB基因設(shè)計和篩選出新的種特異性強的引物，建立和優(yōu)化熒光假單胞菌PCR檢測體系，并對其進行系統(tǒng)評價。
　　首先通過比對熒光假單胞菌及其它原核生物的基因組序列，

3、發(fā)掘出4段熒光假單胞菌特異性片斷作為候選分子檢測靶點，同時也對16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列、gyrB基因進行信息學(xué)分析。對上述6個分子靶點分別設(shè)計常規(guī)PCR引物，并經(jīng)實際實驗特異性初篩，選取gyrB基因為檢測靶點，建立常規(guī)PCR和熒光定量PCR檢測體系，并進行系統(tǒng)評價，結(jié)果如下：
　　1.熒光假單胞菌常規(guī)PCR檢測體系：
　　1) PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：通過對退火溫度、Mg2+濃度的優(yōu)化選擇，建立相應(yīng)的熒光假單胞菌

4、常規(guī)PCR檢測體系；
　　2)特異性：經(jīng)11株熒光假單胞菌和28株非熒光假單胞菌驗證，該體系擴增熒光假單胞菌基因組DNA可得到一條271 bp的特異性條帶，擴增非熒光假單胞菌基因組DNA則無條帶；
　　3)靈敏度：純DNA檢測靈敏度為14.3 fg/μL(2~3 copies/μL)，純培養(yǎng)物檢測靈敏度為3.0×102 CFU/mL；向25 mL無菌豆奶樣品中添加2.2 CFU熒光假單胞菌時，增菌15 h可檢測到陽性結(jié)果，整

5、個檢測過程可在18 h內(nèi)完成；
　　4)抗干擾能力：當背景干擾菌總量達到108 CFU/mL時，經(jīng)過15 h增菌培養(yǎng)，可準確檢測熒光假單胞菌的存在；
　　5)檢出率：5種（56份）實際樣品中熒光假單胞菌檢出率為19.6％，高于培養(yǎng)法的檢出率1.8%。
　　2.基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測熒光假單胞菌體系：
　　1) PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：通過對退火溫度、探針濃度的優(yōu)化選擇，建立相應(yīng)的熒光假單胞菌熒光定

6、量PCR檢測體系；
　　2)特異性：經(jīng)11株熒光假單胞菌和28株非熒光假單胞菌驗證，該體系擴增熒光假單胞菌基因組DNA可采集到Ct值＜35的熒光信號，擴增非熒光假單胞菌基因組DNA則無熒光信號或Ct值＞35；
　　3)靈敏度：純DNA檢測靈敏度為14.3 fg/μL(2~3 copies/μL)，純培養(yǎng)物檢測靈敏度為3.0×102 CFU/mL；向25 mL無菌豆奶樣品中添加2.2 CFU熒光假單胞菌時，增菌15 h可檢測到