河豚魚(yú)成分熒光PCR檢測(cè)方法建立及應(yīng)用.pdf

1、河豚魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩,味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,享有“魚(yú)中之王”的美譽(yù),備受美食家的青睞。但是河豚魚(yú)內(nèi)臟、卵巢、血液、魚(yú)皮、魚(yú)頭等部位含有劇毒,如加工處理不當(dāng)或誤食常會(huì)引起中毒,甚至死亡。一般人由于沒(méi)有相關(guān)的專(zhuān)業(yè)知識(shí),有時(shí)也會(huì)因?yàn)椴荒茏R(shí)別河豚魚(yú)而誤食引起中毒死亡,尤其是對(duì)于各種已經(jīng)加工成魚(yú)片、魚(yú)糜等產(chǎn)品,很難靠人的感觀來(lái)識(shí)別的；近年來(lái),有人故意或無(wú)意地把河豚魚(yú)下腳料加工成魚(yú)片或魚(yú)糜,混在其他魚(yú)產(chǎn)品中,銷(xiāo)售到市場(chǎng),甚至是國(guó)外,引起了食物中毒事件,這在

2、一定程度上影響了我國(guó)的魚(yú)糜制品的銷(xiāo)售信譽(yù)。本研究的目的是采用熒光PCR方法,建立了簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的河豚魚(yú)成分檢測(cè)方法,用于相關(guān)魚(yú)產(chǎn)品的檢測(cè)。
　　 細(xì)胞色素B基因常用于魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)、親緣關(guān)系、魚(yú)類(lèi)物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)記等,本課題根據(jù)河豚魚(yú)細(xì)胞色素B基因序列,設(shè)計(jì)并合成引物和探針,從河豚魚(yú)細(xì)胞(組織)中提取DNA,擴(kuò)增細(xì)胞色素B基因片段,回收PCR擴(kuò)增片段,克隆到pGEM-T載體,重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定,抽提質(zhì)粒,梯度稀釋作為陽(yáng)性

3、標(biāo)準(zhǔn)品,用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定和樣品檢測(cè),通過(guò)優(yōu)化Mg2+、酶等反應(yīng)條件,建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái),并對(duì)其有效率、敏感性、特異性進(jìn)行了檢測(cè)。該檢測(cè)技術(shù)對(duì)檢測(cè)河豚魚(yú)成分靈敏度可以達(dá)到100拷貝數(shù)左右,對(duì)暗鰭腹刺魨、黑腮兔頭魨、棕斑腹刺魨、陽(yáng)性質(zhì)粒、青占魚(yú)、竹莢魚(yú)、魷魚(yú)、帶魚(yú)、三文魚(yú)等進(jìn)行特異性試驗(yàn),結(jié)果只有暗鰭腹刺魨黑腮兔頭魨、棕斑腹刺魨、陽(yáng)性質(zhì)粒出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線(xiàn)。在魚(yú)糜中混入一定量的河豚魚(yú)魚(yú)糜,采用五點(diǎn)采樣法和常規(guī)采樣法進(jìn)行模擬樣品的