辛德畢斯病毒熒光PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、本文擬在我國分離到的SINV基礎(chǔ)上，建立能特異性檢測該病毒核酸的SYBR GREEN I熒光定量PCR檢測方法，并初步應(yīng)用于我國部分地區(qū)采集到的病毒性腦炎/不明原因發(fā)熱病人臨床標(biāo)本和媒介蚊標(biāo)本的檢測，同時(shí)以常規(guī)RT-PCR檢測方法作為對照以對新方法進(jìn)行評價(jià)，了解SINV在我國部分地區(qū)疑似病人及媒介蚊中的流行和分布狀況，為將來臨床標(biāo)本和媒介蚊標(biāo)本中sINV的早期快速檢測和調(diào)查SINV在我國的流行情況提供新的技術(shù)手段。 一、辛德畢斯

2、病毒熒光PCR檢測方法的建立。根據(jù)SINV基因組核苷酸序列特性設(shè)計(jì)引物。病毒在BHK-21細(xì)胞上繁殖擴(kuò)增后提取RNA和逆轉(zhuǎn)錄。以病毒cDNA為模板分別進(jìn)行SYBR GREEN I熒光PCR和常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增，并對SYBR GREEN I熒光PCR法的靈敏性、特異性、重復(fù)性等進(jìn)行分析。結(jié)果最適退火溫度為55℃，最適引物濃度為0.5μmol/L。用該方法檢測2株SINV株YN87448和XJ160結(jié)果均為陽性，而對其他蟲媒病毒如甲病毒屬

3、Geta病毒、乙腦病毒、Batai病毒、Seadoma病毒、環(huán)狀病毒及西方馬腦炎病毒合成模板檢測時(shí)結(jié)果均為陰性。根據(jù)病毒空斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將YN87448病毒懸液進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋后，分別用常規(guī)PCR和SYBRGREEN I熒光PCR方法進(jìn)行檢測，可見SYBR GREEN I熒光PCR檢測敏感性比常規(guī)PCR方法高近100倍，檢出下限可達(dá)0.1PFU/mL。利用4個(gè)不同模板濃度樣品分別進(jìn)行5次檢測以進(jìn)行穩(wěn)定性分析，對Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，

4、得到各樣品Ct變異系數(shù)均<5％。 二、辛德畢斯病毒熒光PCR檢測方法的初步應(yīng)用。 1.模擬感染血清標(biāo)本和部分臨床腦脊液(CSF)標(biāo)本的檢測應(yīng)用新建立的方法對模擬感染的人血清標(biāo)本和7份臨床CSF標(biāo)本進(jìn)行檢測，根據(jù)Ct值及熔解曲線分析，結(jié)果可見標(biāo)本中其他成分對檢測體系無明顯影響，對結(jié)果判定無干擾。 2.辛德畢斯病毒熒光PCR檢測方法在檢測臨床標(biāo)本中的應(yīng)用用新建立的熒光PCR方法及常規(guī)RT-PCR檢測方法對2003～2

5、005年間在云南和河南4所醫(yī)院中采集的248份病毒性腦炎或不明原因發(fā)熱病人的臨床CSF/血清標(biāo)本進(jìn)行了檢測。結(jié)果云南大理州107份標(biāo)本中，熒光PCR檢測7份為陽性，其中3份為病毒性腦炎病人血清標(biāo)本，4份為不明原因發(fā)熱病人血清標(biāo)本，RT-PCR檢測6份陽性(經(jīng)測序證實(shí)為SINV，包括在熒光PCR檢測陽性結(jié)果中)；西雙版納州97份標(biāo)本中，熒光PCR檢測17份為陽性，其中3份為病毒性腦炎病人CSF標(biāo)本，14份為不明原因發(fā)熱病人血清標(biāo)本，RT-

6、PCR檢測1份陽性(包括在熒光PCR檢測陽性結(jié)果中)；云南昆明、河南鄭州醫(yī)院中采集的疑似病人標(biāo)本未檢出SINV。 3.辛德畢斯病毒熒光PCR檢測方法在檢測蚊蟲標(biāo)本中的應(yīng)用用新建立的SINV熒光PCR檢測方法及常規(guī)RT-PCR檢測方法對我國云南、四川、東北地區(qū)采集的106份(100只/份)蚊標(biāo)本進(jìn)行了檢測。結(jié)果云南23份蚊標(biāo)本中熒光PCR檢測3份為陽性，RT-PCR檢測1份陽性(經(jīng)測序證實(shí)為SINV，包括在熒光PCR檢測陽性結(jié)果中

7、)；四川49份蚊標(biāo)本中熒光PCR檢測4份為陽性，RT-PCR檢測1份陽性(經(jīng)測序證實(shí)為SINV，包括在熒光PCR檢測陽性結(jié)果中)；東北地區(qū)34份蚊標(biāo)本中未檢出SINV。 綜上所述，本研究成功建立了SINV特異性核酸的SYBR GREEN I熒光PCR檢測方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了較好的靈敏性、特異性和廣譜性。將新建立的方法初步應(yīng)用于我國部分地區(qū)采集的疑似病人臨床標(biāo)本和蚊標(biāo)本中的SINV檢測，結(jié)果云南省大理州和西雙版納州的腦炎病人，尤其

8、是不明原因發(fā)熱病人標(biāo)本中檢測到多份SINV陽性，說明云南省存在SINv的流行，SINV可能為引起不明原因發(fā)熱的重要病原體之一；從云南地區(qū)蚊標(biāo)本中檢出了SINV特異性核酸，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道云南省曾發(fā)現(xiàn)SINV在媒介蚊群中流行一致，四川地區(qū)蚊標(biāo)本中檢出SINV特異性核酸，提示這些地區(qū)人群中可能存在SINV的潛在感染。兩種PCR檢測方法比較可看出，新建立的SINV熒光PCR檢測方法比常規(guī)RT-PCR方法操作簡便、快速、檢測靈敏度更高，可替代常