豬輪狀病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬輪狀病毒感染(Porcine rotavirus，PoRV)是一種嚴重的接觸性腸道傳染病，導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和消瘦等臨床癥狀，也能夠致使仔豬死亡，特別是對7日齡左右的仔豬造成的危害最為嚴重。該病主要暴發(fā)于寒冷時期的冬季以及早春時節(jié)，且傳播迅速，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的損失。現(xiàn)階段實驗室對PoRV病原的檢測主要是利用常規(guī)RT-PCR方法，但是常規(guī)RT-PCR方法相對于熒光定量RT-PCR靈敏度較低。常規(guī)RT-PCR只能檢測到發(fā)病嚴

2、重時期的豬只，對輪狀病毒感染早期的豬只，則需要靈敏度更高的檢測方法來實現(xiàn)，以達到在豬感染的潛伏期就可以診斷并采取有效的防控措施來減少PoRV的暴發(fā)帶來的損失。
　　 本試驗主要是為臨床檢測PoRV建立靈敏性更高的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)GenBank中登錄的A群豬輪狀病毒(PoRV)TM-a毒株序列，我們針對結(jié)構(gòu)蛋白VP6基因設(shè)計了一對常規(guī)RT-PCR特異性引物和一對熒光定量RT-PCR特異性引物和探針，將通過

3、常規(guī)RT-PCR擴增VP6獲得的目的片段與pMD-18T載體連接構(gòu)建標準陽性質(zhì)粒，建立了檢測A群PoRV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，并對該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性進行了評價。通過熒光定量RT-PCR反應(yīng)獲得的標準曲線可知，反應(yīng)中模板DNA的量與熒光定量RT-PCR的CT值呈一定的線性關(guān)系，且得其直線方程是y=-3.979gx+43.152，相關(guān)系數(shù)達到0.997。此方法可以檢測出最低的PoRV的cDNA濃度為4.6×10

4、2 copies/μL。在跟常規(guī)RT-PCR檢測方法進行對比后得知，新方法的敏感度要比常規(guī)RT-PCR方法高100倍。用該方法檢測豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒(PCV2)均為陰性。研究結(jié)果表明，該方法敏感性高、特異性強、重復(fù)性好，因此對豬群的早期感染體內(nèi)低病毒拷貝數(shù)時都能做出準確的判斷，對防治PoRV的暴發(fā)

5、能夠起到重要作用。
　　 用本實驗室分離的豬輪狀病毒TM-a毒株對三日齡仔豬進行攻毒試驗，此毒株的TCID50為10-6.58/0.1ml，用新建立的熒光定量RT-PCR方法測得病毒液的病毒拷貝數(shù)為1.8×106 copies/μL。選取PoRV陰性的16頭三日齡仔豬，分成4組:空白對照組，口服4×106 TCID50的低劑量組，口服2×107 TCID50的中劑量組，口服1×108 TCID50的高劑量組。本研究成功地復(fù)制出了

6、輪狀病毒感染仔豬的病理模型:高、中、低劑量組分別于第12h、18h、30h采集的糞拭子開始檢測到病毒，并且分別于36h、48h、60h開始出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀;通過熒光定量RT-PCR方法檢測試驗仔豬攻毒后每隔6h的糞拭子PoRV拷貝數(shù)，探索豬感染PoRV后的排毒規(guī)律，結(jié)果表明，隨著時間的延長糞樣中的病原拷貝數(shù)也增加，并且在96h達到峰值1.8×107copies/μL;通過病理組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)，攻毒組小腸出現(xiàn)嚴重病變，腸絨毛