鴨源呼腸孤病毒熒光定量RT-PCR方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、禽呼腸孤病毒可以通過自然和人工感染雞、火雞、鴨、鵝等禽類,在世界范圍內(nèi)廣泛流行。國內(nèi)外多位學(xué)者從多種病禽體內(nèi)分離到呼腸孤病毒,研究發(fā)現(xiàn)不同種禽類感染呼腸孤病毒后所表現(xiàn)的臨床癥狀、病理變化有顯著差異,給該病的診斷帶來了極大困難。我國主要肉鴨養(yǎng)殖地區(qū)均報(bào)道鴨源呼腸孤病毒感染嚴(yán)重并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,尋找一種先進(jìn)的技術(shù)來快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測鴨源呼腸孤病毒已經(jīng)成為該病診斷、治療的迫切需要和必然趨勢。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中鴨源呼腸孤病

2、毒S2基因序列中的保守序列設(shè)計(jì)一對特異性引物,在建立鴨源呼腸孤病毒熒光定量RT-PCR的基礎(chǔ)上,應(yīng)用此方法檢測該病毒在不同組織內(nèi)的分布與含量,對閻明該病發(fā)病機(jī)理,疾病的預(yù)防與診斷以及流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備:根據(jù)鴨源呼腸孤病毒S2基因區(qū)域中的保守序列,設(shè)計(jì)并合成了一對可以擴(kuò)增285bp的引物,擴(kuò)增目的片段。然后將此目的基因克隆到pMD18-T載體中,將重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中

3、,經(jīng)過PCR鑒定和測序鑒定,篩選出重組陽性質(zhì)粒,命名為pMD18-TS2。用核酸蛋白儀進(jìn)行質(zhì)粒純度和濃度的測定,檢測三次后取平均值。將質(zhì)粒濃度通過公式換算成拷貝數(shù)為1.48×1010 copies/μL。定量后,將其10倍梯度稀釋至1.48×100 copies/μL。
　　 2.熒光定量RT-PCR方法的建立與優(yōu)化以陽性質(zhì)粒pMD18-TS2為模板,通過對退火溫度和引物濃度等的優(yōu)化,使整個(gè)反應(yīng)達(dá)到最佳。按照優(yōu)化的反應(yīng)條件,以定

4、量的10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。結(jié)果顯示,各濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線間呈現(xiàn)良好的梯度分布,標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值和起始模板拷貝數(shù)在1.48×109拷貝～1.48×101拷貝間具有良好的線性關(guān)系。線性回歸方程函數(shù)表達(dá)式為Y=-3.444X+39.344(X代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù),Y代表Ct值),Ct值與起始模板的拷貝數(shù)的相關(guān)性為0.998,而且反應(yīng)的擴(kuò)增效率可達(dá)95.16％。另外特異性試驗(yàn)表明此方法對鴨源呼腸孤病

5、毒的檢測特異性強(qiáng),與鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨疫里默氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、鴨源沙門氏菌等無交叉反應(yīng)。對高、中、低不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測的批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為0.94％-3.57％,批間重復(fù)變異系數(shù)為1.12％-5.61％,顯示出良好的重復(fù)性。
　　 3.常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR的比較對收集的80份人工感染樣品和10份臨床樣品分別用常規(guī)RT-PCR和本文建立的熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,人工感染的樣品組

6、織中,熒光定量RT-PCR檢出率(52.5％)高于常規(guī)RT-PCR(45％)。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,在人工感染雛鴨收集的8種組織中,均能檢測到病毒存在。脾、法氏囊、胸腺和肺臟的檢出率較高,而肝臟、胰臟檢出率較低。單因素方差分析結(jié)果顯示,脾臟組的病毒含量高于其它組病毒含量(P<0.05)。在檢測的10個(gè)臨床樣品中,熒光定量RT-PCR檢出率(60％)仍高于常規(guī)RT-PCR(30％)。
　　 研究結(jié)果表明:建立的熒光定量RT