Ⅰ型鴨肝炎病毒浙江分離株序列分析與RT-PCR檢測方法建立.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis，DVH)又稱鴨肝炎，是由鴨病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis virus，DHV)引起的一種急性、高度致死性的傳染病，以肝炎為主要特征，主要發(fā)生于三周齡以下雛鴨。近年來該病的發(fā)病率和死亡率不斷上升，嚴(yán)重危害了養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。鴨肝炎病毒有三個(gè)血清型，分別引起I型、II型和Ⅲ型鴨肝炎，其中I型和Ⅲ型屬于小RNA病毒科，II型屬于星狀病毒科。國內(nèi)外主要流行I型鴨肝炎。

2、 本研究利用3'RACE方法擴(kuò)增并克隆了4株鴨肝炎病毒(DHV)(ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株)的基因組的3'末端真實(shí)序列，包括部分非結(jié)構(gòu)蛋白(3D)基因以及緊接著3D基因下游的3'端非編碼區(qū)(untranslatedregion，UTR)和poly(A)尾巴。測序結(jié)果表明，擴(kuò)增的特異性片段長度為597 nt(不包括polyA尾巴)。各毒株3'UTR均為314 nt，位于終止密碼子TGA之后，比對分析結(jié)果表明各毒株間的同源性較

3、高：4株DHV3'末端核苷酸序列(不包括polyA尾巴)之間的同源性為96.3％～100％，而與參考毒株之間的同源性為93.5％～99.7％。在系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹上，各毒株親緣關(guān)系較近。 根據(jù)己發(fā)表的I型鴨病毒性肝炎病毒(Duck virual hepatitis virus type I，DHV-I)的基因組序列，設(shè)計(jì)并合成了覆蓋DHV-I全基因組序列的8對特異性引物，利用RT-PCR方法擴(kuò)增得到了DHV-I Z10株基因組的各片

4、段，其中病毒基因組3'末端序列的擴(kuò)增是通過RACE方法得到。將擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆于pMD-18T載體中進(jìn)行測序，測序結(jié)果拼接后，進(jìn)行BLAST在線同源搜索，確定為I型鴨肝炎病毒基因組序列，并利用分子生物學(xué)軟件對Z10株序列組成，以及DHV的分子演化關(guān)系等進(jìn)行輔助分析。序列分析表明Z10株全基因組由7688個(gè)核苷酸組成，基因組中只含有一個(gè)大的閱讀框架(ORF)，編碼2249個(gè)氨基酸，多聚蛋白裂解位點(diǎn)比較保守，最終形成12個(gè)成熟的蛋白，依次為

5、VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D。對Z10株全基因組序列與GenBank上發(fā)表的6株DHV基因組全序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果表明，Z10株與DHV-I CL株親緣關(guān)系最近，核苷酸序列一致性為98.4％；與H株核苷酸序列同源性最低，為95.3％。與03D株序列比對顯示，Z10株沒有發(fā)生堿基插入或缺失；且在其基因組5'端有一個(gè)長達(dá)626 nt的非編碼區(qū)(NCR)，3NCR含有314個(gè)核苷酸(不包

6、括poly(A)尾巴)。 根據(jù)GenBank中已登錄的DHV VP1基因的序列設(shè)計(jì)1對引物，采用RT-PCR方法成功地?cái)U(kuò)增出4株I型鴨肝炎病毒(DHV)(分別命名Z05、Z06、Z07、Z10)的VP1全基因的cDNA片段，將4個(gè)cDNA片段分別克隆到pMD18-T Vector載體中進(jìn)行序列測定，得到4個(gè)毒株VP1基因的序列。應(yīng)用分子生物學(xué)軟件分析其與目前GenBank上發(fā)表的具有代表性的DHV-I VP1基因的遺傳變異，分析

7、結(jié)果表明4株I型鴨肝炎毒株VP1基因cDNA長度均為714 bp，編碼238個(gè)氨基酸。經(jīng)比對分析得知4株DHV-I之間VP1基因的核苷酸序列相似性93.0％～99.7％，氨基酸序列相似性為95.4.％～100％；與參考毒株的VP1基因的核苷酸序列相似性91.2％～99.7％，氨基酸序列相似性為94.5％～98.7％，各毒株的親緣關(guān)系較近。根據(jù)VPl的氨基酸序列，繪制了不同DHV-1分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，其中3株浙江分離株屬于同一

8、基因群，VP1氨基酸變異主要表現(xiàn)為羧基端出現(xiàn)多處氨基酸置換，提示VP1可能含有DHV-I的毒力相關(guān)的位點(diǎn)。本試驗(yàn)從基因水平上研究病毒的進(jìn)化情況，揭示與其他毒株的親源關(guān)系，分析其基因型，為該病在流行病學(xué)和預(yù)防控制方面的研究奠定基礎(chǔ)。 根據(jù)已知的基因組序列，設(shè)計(jì)、合成了1對能快速檢測DHV-I的特異性引物，并建立了DHV-I的RT-PCR檢測方法。與傳統(tǒng)的DHV-I檢測方法相比，該方法具有快速、敏感和高度特異性等技術(shù)優(yōu)勢，可應(yīng)用于D