鴨甲肝病毒1和3型一步法雙重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、鴨病毒性肝炎(DVH)是雛鴨的一種急性傳染性病，主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨。該病由至少三種不同的病原引起，包括鴨甲肝病毒(DHAV)、1型鴨星狀病毒(DastV-1)和2型鴨星狀病毒(DastV-2)。分布范圍最廣的DHAV屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬?；谥泻驮囼?yàn)和系統(tǒng)發(fā)育分析，DHAV已被分為三種基因型(DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3)。其中，DHAV-1分布范圍最廣泛，DHAV-2僅在臺灣發(fā)現(xiàn)報(bào)道，而近幾年DHAV-3已經(jīng)

2、給我國大陸地區(qū)和韓國的養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重危害。DHAV-1與DHAV-2之間無交叉中和反應(yīng)，DHAV-1和DHAV-3之間交叉保護(hù)作用不明顯。通過對雛鴨的臨床癥狀和剖檢病變可以初步對DVH進(jìn)行診斷，但是該方法不能夠區(qū)分DHAV-1和DHAV-3。目前血清學(xué)診斷技術(shù)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)已經(jīng)用DHAV的檢測和診斷，血清學(xué)診斷技術(shù)主要包括中和試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和免疫熒光抗體技術(shù)等，但是由于其繁瑣耗時(shí)和成本高，不能用于快速診斷。分子生

3、物學(xué)診斷技術(shù)包括RT-PCR和RT-LAMP方法等，能夠快速特異地對DHAV分離株和臨床樣品進(jìn)行診斷，因此建立一種能夠快速鑒別診斷DHAV-1和DHAV-3的一步法雙重RT-PCR方法對我國DVH的防治有積極的作用。
　　1.建立一步法雙重RT-PCR方法用于檢測DHAV-1和DHAV-3
　　為了能夠快速鑒別診斷DHAV-1和DHAV-3，本研究根據(jù)GenBank中DHAV-1和DHAV-3的全基因組序列，在DHAV-1和

4、DHAV-3的基因保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)了2對特異性引物，并成功建立一步法雙重RT-PCR方法鑒別診斷DHAV-1和DHAV-3。該一步法雙重RT-PCR方法能夠分別針對DHAV-1和DHAV-3特異性地?cái)U(kuò)增出992bp和1533bp的目的片段，而對健康雛鴨肝臟組織、番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒、禽流感病毒、鴨疫里默氏菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌核酸的檢測結(jié)果為陰性。該方法最低能夠檢測出10pg DHAV-1和DHA

5、V-3的RNA，具有較高的敏感性。
　　2.應(yīng)用一步法雙重RT-PCR方法檢測DHAV-1和DHAV-3
　　本研究中使用建立好的一步法雙重RT-PCR方法DHAV人工感染雛鴨和DHAV分離株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該一步法雙重RT-PCR方法的檢測結(jié)果和病毒分離實(shí)驗(yàn)完全一致。應(yīng)用建立好的一步法雙重RT-PCR方法對從2012～2014年在四川、山東、湖北和廣西省采集的52份疑似DVH病料進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示52份病料中有41份為D