禽傳染性支氣管炎病毒一步法RT-PCR檢測試劑盒的研制及應(yīng)用.pdf

1、本實驗對異硫氰酸胍一步法、Trizol試劑法和RNA抽提試劑盒法三種不同的病毒RNA提取方法做了對比試驗，用紫外光檢測RNA純度和電泳檢測RNA的完整性的方法對三種提取方法作為評價指標，以找出適合禽傳染性支氣管炎病毒RNA提取方法。結(jié)果表明：三種RNA提取方法的對比實驗表明三種方法中，異硫氰酸胍一步法提取的RNA樣品純度不高，且不完整；Trizol試劑法和RNA抽提試劑盒法提取的RNA樣品純度和完整性都較理想，兩者提取效果差異不顯著，考

2、慮到成本的因素，本研究選用Trizol試劑法做為今后的RNA提取方法； 通過在IBV非結(jié)構(gòu)基因3abc的保守區(qū)域設(shè)計一對引物，對引物的特異性進行檢驗；建立和優(yōu)化了一步法RT-PCR，在此基礎(chǔ)上組裝成一步法RT-PCR檢測試劑盒。引物的特異性實驗表明，用該引物對IBV分離株和IBV標準株檢測成陽性，而對IBDNA疫苗和雞相關(guān)病原體檢測呈陰性，陽性產(chǎn)物回收后測序表明，擴增出的陽性片段為IBV的3abc基因。 通過對8株IBV

3、國內(nèi)分離株和3株國內(nèi)標準株以及IBDNA疫苗(S1、M和N三基因混合)和4株雞常見病原體的檢測來檢驗試劑盒的特異性。結(jié)果表明，試劑盒對IBV分離株和IBV標準株檢測成陽性，而對IBDNA疫苗和雞相關(guān)病原體檢測呈陰性；用試劑盒對不同濃度的病毒RNA模板進行檢測來檢驗試劑盒的靈敏度結(jié)果表明：試劑盒最低可以檢測出濃度為10-3ng/μl的IB病毒RNA模板；通過在試劑盒組裝后的6個月內(nèi)定期用試劑盒對IBV毒株、IBDNA疫苗和雞常見病原體的檢

4、測，來檢驗試劑盒的穩(wěn)定性和重復性，結(jié)果表明：6個月后，試劑盒的穩(wěn)定性未下降，具有較好的靈敏度和特異性。 用一步法RT-PCR試劑盒、兩步法RT-PCR和ELISA方法對人工感染雞進行對比檢測。結(jié)果表明：試劑盒和兩步法RT-PCR均能特異地檢測出IBV，試劑盒比兩步法RT-PCR節(jié)省了1.5小時的檢測時間，并節(jié)約了成本，減少了試劑污染的可能。試劑盒和ELISA方法均能特異地檢測出IBV，試劑盒比ELISA方法提前36小時檢測出IB

5、V。 試劑盒對IBDNA疫苗免疫雞、人工IBV感染雞和自然感染病例進行檢測。結(jié)果表明，試劑盒對IBDNA疫苗免疫的檢測全部呈陰性；試劑盒可以對人工IBV感染雞進行早期檢測；試劑盒對自然感染病例的檢測結(jié)果與IBV的分離鑒定結(jié)果一致。 本研究建立的RT-PCR一步法試劑盒對IBV的檢測具有快速、簡便和準確的特點，相對于傳統(tǒng)的兩步法RT-PCR更快速和簡便，相對于ELISA方法更加適合IB的早期檢測。通過在IBV的非結(jié)構(gòu)基因3