禽傳染性支氣管炎病毒M基因在畢赤酵母中表達(dá)與蛋白活性檢測.pdf

1、本文根據(jù)本課題組在GenBank中注冊的禽傳染性支氣管炎病毒中國分離株SAIBK株的M基因序列(注冊號(hào)AY302742)及畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K的序列設(shè)計(jì)引物，通過雞胚培養(yǎng)收獲禽傳染性支氣管炎病毒，提取病毒RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出IBV M基因，構(gòu)建了克隆載體pMD18-M，通過菌落PCR和酶切對克隆載體進(jìn)行了鑒定。將克隆載體pMD18-M和酵母表達(dá)載體pPIC9K分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切

2、，回收目的片段，用T4 DNA連接酶將兩者連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選得到酵母表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定M基因已經(jīng)正確地連接到pPIC9K上。用限制性內(nèi)切酶Sac I將表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-M線性化，然后用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入畢赤酵母GS115中。將在MD平板上生長的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過PCR鑒定、表型篩選和不同G418抗性濃度篩選后，獲得整合型陽性重組菌株，命名為GS115/pPIC9K-MHis<'+>.Mut<'+>。將重組菌株在1％的甲醇中進(jìn)行誘導(dǎo)分泌

3、表達(dá)，通過收集不同時(shí)間段的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，在誘導(dǎo)72小時(shí)后目的蛋白表達(dá)量最大，表達(dá)蛋白占上清中總蛋白量的13.3％，表達(dá)蛋白的分子量約為33KD。 通過Western-blot檢測顯示，表達(dá)蛋白能與IBV陽性血清特異性結(jié)合。對表達(dá)蛋白進(jìn)行初步純化后，以M蛋白為包被抗原的ELISA檢測結(jié)果顯示表達(dá)蛋白與特異性抗體反應(yīng)良好，表明表達(dá)的M蛋白生物學(xué)活性良好。目前國內(nèi)外還沒有利用畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K來