傳染性支氣管炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp5抗體ELISA檢測技術(shù)的研究.pdf

1、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）是禽傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)的病原體，可引起雞急性、高度接觸性傳染病，持續(xù)威脅著世界養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。本研究制備了IBV非結(jié)構(gòu)蛋白5和10(nsp5和nsp10)的單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb），并以原核表達的重組蛋白GST-nsp5為包被抗原，建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzy

2、me-linkedimmunosorbent assay, ELISA）檢測方法，用于IBV血清抗體的檢測。
　　利用原核表達系統(tǒng)，在體外重組表達IBV腎型毒株SC021202 nsp5和nsp10的基礎(chǔ)上，以純化的重組蛋白His-nsp5和His-nsp10為免疫原分別免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，結(jié)合ELISA、IFA和Western blot技術(shù)，應(yīng)用有限稀釋克隆法篩選能分泌有效抗體的雜交瘤細胞株。

3、結(jié)果各獲得了2株分別針對nsp5(1E2，2B10)和nsp10(1G2，3G7)的mAb分泌細胞。Westernblot分析顯示針對nsp5和nsp10的雜交瘤細胞株分泌上清均與各自對應(yīng)的蛋白有良好的特異性反應(yīng);IFA檢測顯示所制備的mAb與不同組織嗜性的IBV毒株的細胞適應(yīng)毒均具有較好的反應(yīng)性。IBV nsp5和nsp10 mAb的制備為IBV的監(jiān)測和鑒別以及進一步了解非結(jié)構(gòu)蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　以重組表達的GST-ns

4、p5融合蛋白為抗原，建立了檢測IBV抗體的間接ELISA方法。通過對ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)條件:抗原包被濃度為3.64μg/ml;包被液為0.01 M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4);待檢血清1∶200稀釋;酶標(biāo)抗體1∶1000稀釋;10％新生牛血清/PBS為封閉液;含0.05％吐溫-20、5％脫脂奶的PBS為樣品稀釋液;待檢血清反應(yīng)時間為60min，酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間為45min，底物反應(yīng)時間10min。以S/P值等

5、于0.12作為IBV抗體陰、陽性血清判定的臨界值。特異試驗表明:ELISA檢測抗原不與禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性法氏囊病毒等陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。同批抗原制備的不同檢測板變異系數(shù)(CV)值在3％-16％之間，不同批抗原制備的檢測板CV值在7％-19％之間。本方法與間接免疫熒光試驗相比，陽性符合率為93.11％、陰性符合率為95.38％、總符合率為93.33％;與進口IBV ELISA檢測試劑盒(IDEXX)相比，陽性符合率為98.1

6、1％，陰性符合率為95％，總符合率為97.62％。應(yīng)用所建立的nsp5 ELISA檢測人工接種IBV后雞血清抗體消長規(guī)律評估了該方法用于檢測IBV血清抗體的有效性。SC021202強毒株感染組在接種后6天即可檢測到nsp5抗體，持續(xù)時間至少為147天。M41滅活苗和H52弱毒苗免疫組nsp5抗體轉(zhuǎn)陽相對于感染組出現(xiàn)時間較晚，分別為接種后9天和12天，其中M41滅活苗免疫組的nsp5抗體持續(xù)時間最短，在接種77天后抗體水平逐漸降低，并在9

7、8天后轉(zhuǎn)陰;H52弱毒苗免疫組在接種91天后出現(xiàn)nsp5抗體水平的逐漸下降，并在接種后133天轉(zhuǎn)陰。通過和IDEXX IBV ELISA試劑盒對IBV血清抗體檢測結(jié)果的比較顯示，三個實驗組在實驗觀察期內(nèi)的絕大部分時期的nsp5抗體和IBV抗體的消長規(guī)律相似，說明本研究所建立的nsp5 ELISA血清抗體檢測方法能夠體現(xiàn)IBV接種后真實的抗體變化規(guī)律，可用于IBV接種后的血清學(xué)檢測。此外，本研究所建立的nsp5 ELISA是首次報道的以I