雞傳染性支氣管炎病毒國內(nèi)分離株基因組的研究.pdf

1、該研究主要對已經(jīng)分離鑒定的三株IBV毒株LH2/01/10(黑龍江腎型株)、D971(大連"腺胃型"株)和LX4(新疆腎型株)進(jìn)行基因分析.首先在10齡SPF雞胚中增殖病毒,當(dāng)病毒尿囊液血凝價穩(wěn)定在256以上時,純化和濃縮病毒,再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcripotion-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增目的基因.該研究首先對三株毒株的主要結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行了克隆和序列測定

2、.設(shè)計引物時將5a、5b、和N基因,3a、3b、3c與M同時擴(kuò)出.構(gòu)建了結(jié)構(gòu)基因N、M、S和3c(E)和非結(jié)構(gòu)基因3a、3b、5a和5b的基因進(jìn)化樹.序列測定表明三者的N基因均由1230bp組成,無堿基的缺失與插入,但存在點突變,編碼409個氨基酸(AA),且與國內(nèi)分離株同源性均較高,而大某些基因區(qū)與H120和H52同源性可達(dá)100％.N基因進(jìn)化樹顯示LH2/01/10、LX4在同一群內(nèi),而D971卻與國外參考毒株更近,表明三者在不同地

3、區(qū)經(jīng)歷不同的進(jìn)化,導(dǎo)致不同基因特征的出現(xiàn).M基因長度不同,LH2/01/10為687bp(228個AA)、D971為681bp(226個AA)、LX4678bp(225個AA),M基因保守程度也較高,進(jìn)化樹表明三者親緣關(guān)系與國內(nèi)毒株近,與國外毒株及疫苗株相對較遠(yuǎn).S蛋白是IBV最重要的免疫原,尤其S1部分可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體,而S1基因在基因組中變異頻率最高.S基因序列分析表明,LH2/01/10與LX4的S基因為3495bp

4、,編碼1164個AA,S蛋白的切割識別位點為5個連續(xù)的堿性氨基酸殘基組氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸(His-Arg-Arg-Arg-Arg,HRRRR),為IBV中國分離毒株所獨(dú)有.二者的S1基因均為1614bp,編碼539個AA;D971S為3498bp,編碼1165個AA,切割識別位點為NSRRR,該序列為所選參考毒株中最為獨(dú)特的一個.D971S1為1614bp,編碼538個AA,S2為1884bp,編碼627個AA.S1基

5、因分析表明不同國家的IBV毒株差異顯著,LH2/01/10與LX4在同一群內(nèi),與H120和H52等疫苗株相對較近,而與國外變異株D1466和DE072等群僅36％同源.D971獨(dú)樹一幟,與國外參考毒株相近,這再次證明D971的獨(dú)特進(jìn)化史.E基因是近年來研究發(fā)現(xiàn)的IBV的另一個結(jié)構(gòu)基因,LH2/01/10E的基因為336bp,D971為309bp,LX4為330bp,三者均表現(xiàn)在3'端變異頻繁,與參考毒株一致.進(jìn)化樹分析表明,LH2/01