雞傳染性支氣管炎病毒IgY抗體基因的擴增及表達(dá).pdf

1、SichuanAgriculturalUniversityMaster，SDegreeDissertationAmplificationandexpressionofIgYantibodygeneagainstavianinfectiousbronchitisvirusZhenzhenDuan(Preventiveveterinarymedicine)DirectedbyYongHuangJune2015中文摘要本研究旨在利用基因工程抗

2、體技術(shù)制備雞傳染性支氣管炎]gY抗體，為雞抗體基因的研究和特異性抗體的制備提供相關(guān)數(shù)據(jù)，同時也為雞傳染性支氣管炎的治療及診斷提供幫助。為了擴增雞IgY抗體基因全長序列，本試驗首先提取雞脾臟總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照NCBI上公布的雞輕鏈抗體基因序列合成特異引物，利用PCR技術(shù)擴增出輕鏈ORF序列。由于網(wǎng)上沒有公布出雞IgY抗體基因的重鏈全長序列，因此我們根據(jù)已公布出的重鏈恒定區(qū)序列設(shè)計引物分別利用5’RACE和3RACE方法擴

3、增后測序驗證，將驗證正確的兩段序列通過DNAStar軟件拼接后找到ORF序列，再次設(shè)計引物利用重疊PCR方法擴增出重鏈OR／：序列。將輕、重鏈擴增出的目的條帶分別連接到克隆載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5ct后，選取單菌落搖菌抽取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PCR雙重驗證正確的質(zhì)粒送往公司測序。序列結(jié)果顯示擴增出的輕鏈ORF序列長705bp，編碼234個氨基酸與己公布的序列同源性達(dá)到95％；重鏈ORF序列長1716bp，編碼571個氨基酸，其可變區(qū)基因

4、序列符合雞抗體重鏈可變區(qū)基因特征，其恒定區(qū)序列與已公布的雞lgY抗體基因重鏈序列同源性達(dá)到99％。說明我們已成功構(gòu)建擴增雞IgY抗體基因輕、重鏈序列的方法。為了表達(dá)雞1BV特異性抗體基因序列，首先將30只1曰齡雛雞隨機分成2組，分別飼養(yǎng)在隔離的動物房中。待母源抗體水平下降后，第一組用弱毒疫苗株4／91進行免疫，14天后進行2免，第二組作為空白組不做處理。一免后每隔7天采集兩組血樣分離血清，間接ELISA法檢測特異性抗體，待抗體水平明顯升

5、高時采集兩組雞脾臟，提取總RNA，擴增抗體基因。發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)之間的變異非常大，而重鏈變異較小。從免疫雞中挑選出一條抗體基因?qū)⑵涠ㄏ蚩寺∪氡磉_(dá)載體pcDNA31中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA31H和pcDNA31L。將測序正確的兩種重組載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后利用間接免疫熒光、RTPCR、間接ELISA等檢測方法對目的蛋白的表達(dá)及其特異性進行檢測。間接免疫熒光結(jié)果顯示在分別轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中均可見綠色熒光，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的細(xì)