膽固醇對雞傳染性支氣管炎病毒感染雞胚腎細(xì)胞的影響.pdf

1、雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectiousbronchitis virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，被認(rèn)為是危害全球養(yǎng)禽業(yè)的主要病毒性傳染病之一。雞胚腎(Chicken embryo kidney，CEK)細(xì)胞源于IBV易感宿主，相較于其他細(xì)胞系更貼近于IBV的感染環(huán)境，且對IBV具有極高的敏感性，接種后能觀察到明顯的細(xì)胞病變，CEK已成為研究IB

2、V感染細(xì)胞致病過程及其機制的適宜宿主細(xì)胞模型。
　　脂筏是質(zhì)膜中富含膽固醇和鞘脂的微結(jié)構(gòu)域，具有介導(dǎo)病毒感染、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白分選等生物學(xué)功能。膽固醇作為脂筏的重要組分，可維持脂筏的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并參與脂筏功能的發(fā)揮。研究表明，膽固醇在某些病毒感染細(xì)胞時扮演著非常重要的作用，包括病毒的進入、吸附和釋放過程，但膽固醇在IBV感染過程中的作用還并未有報道。
　　本實驗分別研究了細(xì)胞膜和病毒囊膜膽固醇在IBV M41株感染CEK細(xì)胞過程中

3、的作用。首先檢測了膽固醇萃取劑甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)對CEK細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MβCD濃度小于10mM時，不會對CEK細(xì)胞活性造成明顯影響，所以本實驗中所用的MβCD最大濃度為10 mM。同時進行膽固醇含量測定，當(dāng)MβCD濃度為10 mM時，細(xì)胞膜膽固醇含量下降至37％，補充外源膽固醇后，膽固醇濃度會得到相應(yīng)恢復(fù)，當(dāng)充補膽固醇濃度為200μM時，膽固醇含量恢復(fù)至接近MβCD處理前。MβCD還能有效去除IBV囊膜膽固醇，用

4、10mM MβCD處理病毒后，病毒囊膜膽固醇含量下降至約66％。
　　本實驗利用Real Time PCR、病毒滴度試驗和Western Blot方法檢測了細(xì)胞膜膽固醇在IBV M41株感染CEK細(xì)胞不同過程中的作用。結(jié)果表明，加入不同濃度MβCD去除細(xì)胞膜膽固醇，會以劑量依賴性的方式抑制IBV的進入，病毒感染力和IBVN蛋白的表達(dá)量也會梯度下降。為進一步確定該抑制作用是由于去除膽固醇引起的，用10 mM MβCD去除細(xì)胞膜膽固醇

5、后再補充外源膽固醇，結(jié)果顯示，隨著補充膽固醇濃度的增加，IBV感染力和蛋白表達(dá)水平均得到相應(yīng)恢復(fù)，說明去除膽固醇可抑制IBV進入CEK細(xì)胞，且該抑制作用是可逆的。本實驗還研究了膽固醇在IBV吸附到CEK細(xì)胞和從CEK細(xì)胞釋放過程中的作用，結(jié)果顯示，隨著MβCD濃度增大，IBV的吸附和釋放過程均受到劑量依賴性的抑制。同時，將CEK細(xì)胞轉(zhuǎn)染GPI-pEGFP后感染IBV，結(jié)果顯示IBV與GPI錨定蛋白可共定位在同一個CEK細(xì)胞膜上，說明IB