雞傳染性支氣管炎免疫膠體金診斷試紙研究.pdf

1、由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞傳染性支氣管炎(1B)(簡稱雞傳支)由丁病毒具有多血清型和多組織嗜性，易丁發(fā)生變異而難以防制，成為養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重大阻力。世界各國都非常重視，對其進行了人量研究。目前雞傳支確切診斷依賴于病毒的分離鑒定、血清學檢測、分子生物學診斷技術以及電鏡技術等。血清學診斷方法包括血凝及血凝抑制實驗，神經(jīng)氨酸酶抑制實驗，瓊脂糖擴散實驗，病毒中和實驗，酶聯(lián)免疫吸

2、附實驗，免疫熒光技術等。但這些檢測方法由于檢測時間較長及檢測所需儀器設備較昂貴，多數(shù)不適于臨床快速檢測。因此，新型快速檢測雞傳支的方法急需建立，本研究利用免疫膠體金層析技術初步實現(xiàn)了對雞傳支的快速檢測，對雞傳支的快速檢測具有重要意義。 本研究將雞傳染性支氣管炎病毒C型株尿囊液經(jīng)蔗糖梯度密度離心純化制取抗原，免疫BALB/C小鼠，將4次免疫后的小鼠脾細胞與SP2/O骨髓瘤細胞融合，融合率達68.3％。經(jīng)間接ELISA檢測、有限稀釋

3、法克隆，篩選出了2株能穩(wěn)定分泌特異性抗雞傳染性支氣管炎抗體的雜交瘤細胞株，依次命名為4D4、4D6，2株單抗的亞類都屬丁lgG1，k型。ElISA檢測時僅與IBV發(fā)生特異性反應，而與其他常見禽類病毒抗原不出現(xiàn)交義反應。獲得的單克隆抗體是制備雞傳染性支氣管炎免疫膠體金快速診斷試紙條的理想試劑。 用IBV C型雞傳支油乳劑疫苗對兔子進行長期免疫，用間接ELISA方法和瓊脂擴散實驗(AGP)進行檢測，得到了高效價的兔抗IBV多克隆抗體

4、。其效價分別為：ELISA法效價達1∶10萬以上，AGF法效價在1∶16-1∶32之間。本實驗用獲得的單克隆抗體和多克隆抗體建立了雞傳支病毒的膠體金免疫層析快速診斷方法。根據(jù)實驗需求制備了30 nm的膠體金顆粒，對單克隆抗體(4D4株)最適穩(wěn)定標記量進行測定，選擇100 ml 0.01％金溶膠中的IBV單抗標記量為12 ug/ml。通過最適穩(wěn)定標記量對單克隆抗體進行標記，成功制備了性能穩(wěn)定、免疫學活性好的金標IBV單克隆抗體，該金標抗體

5、在4℃保存半年有沉淀或分層現(xiàn)象。 將制備好的金標抗體及經(jīng)辛酸一飽和硫酸銨法提純的兔抗IBV IgG用于免疫膠體金診斷試劑條的制備。反應體系將金標抗體固定于玻璃纖維膜上作為顯色源，將兔抗IBV IgG包被在硝酸纖維素膜上作為捕獲線，羊抗鼠IgG同定硝酸纖維素膜上作為質(zhì)檢線，通過確定各部分最佳噴涂量后制成免疫膠體金診斷試紙條。在檢測過程中若待檢樣晶中含有IBV抗原，則在有效的檢測試劑條上捕獲線和質(zhì)檢線處均出現(xiàn)一條紅線，若待檢樣品中不

6、含IBV抗原則只在質(zhì)檢線處出現(xiàn)一條紅線。通過結果的判定，該快速檢測測試條靈敏度可達5 ng/ml。同時本試驗用單克隆抗體和多克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA法用丁檢測雞傳染性支氣管炎病毒，該方法靈敏度可達3.75 ng/ml，標準曲線在3.75ng/ml-500ng/ml范圍內(nèi)線性良好。通過與免疫膠體金診斷方法進行比較，二者檢測符合率達90％以上。 本研究成功制備了抗IBV的多克隆抗體及抗IBV共同表何的單克隆抗體，并將其應用