檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒抗體間接ELISA方法的研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(IB)是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的高度接觸性急性傳染病。該病在世界各地廣泛流行，病患雞常表現(xiàn)咳嗽，打噴嚏和氣管噦音等呼吸道癥狀，并導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)的下降，肉雞飼料轉(zhuǎn)化率降低、平均日增重小，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。體液免疫在IB的防治中發(fā)揮重要作用。IBV抗體檢測(cè)是評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量和免疫程序合理性的重要依據(jù)。檢測(cè)IBV抗體的方法較多，但是適宜于生產(chǎn)上大批量檢測(cè)的方法依然是間接ELISA方法。本文通過(guò)自制酶標(biāo)

2、二抗，建立了檢測(cè)IBV抗體的間接ELISA方法，為該方法的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)使用辛酸-硫酸銨法、DEAE-52-纖維素離子交換層析法和Sephadex G200分子篩層析法純化雞血清IgG。用SDS-PAGE電泳對(duì)純化得到的雞血清IgG進(jìn)行純度檢測(cè)，檢測(cè)電泳圖中除65KD和25KD兩條蛋白條帶，幾乎看不到其他條帶，表明所得IgG純度高。用核酸蛋白儀測(cè)得純化、濃縮后的雞血清IgG濃度為3.8mg/mL。按常規(guī)方法免疫兔

3、子，制得瓊擴(kuò)效價(jià)1∶32的兔抗雞高免血清，采用過(guò)碘酸鈉法制備酶標(biāo)HRP兔抗雞IgG，酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為0.25μg/mL。利用雞傳染性支氣管炎病毒和自制的酶標(biāo)HRP兔抗雞IgG建立了檢測(cè)IBV抗體的間接ELISA方法并優(yōu)化得到了最佳反應(yīng)條件:病毒粒子最適包被濃度為18.5μg/mL;最適包被條件為37°，2h或4℃過(guò)夜;最佳封閉液和最適封閉時(shí)間為5％脫脂奶粉，37℃封閉2h;最佳血清稀釋液為0.1％ BSA;待測(cè)血清的最佳稀釋度為1

4、∶400;與包被抗原最適反應(yīng)條件時(shí)間為37℃1h;酶標(biāo)二抗與血清樣品的最佳反應(yīng)條件為37℃1h;底物在暗處室溫顯色15min，按照本研究建立的ELISA方法確定血清陰性、陽(yáng)性的臨界值（OD450nm）為0.133。用本方法對(duì)M41，H120，28/86，Ma5，W93，4/91,CK/CH/SCEM/09I，CK/CH/SCMS/10I,CK/CH/SCMY/10I和CK/CH/SCYA/10I等IBV毒株的抗血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均呈

5、陽(yáng)性。與已知的SPF雞陰性血清、AIV(H5)抗血清、AIV(H9)抗血清、ND（lasota株）抗血清、IBDV抗血清均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明建立的間接ELISA有較好的特異性。本方法的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果顯示，批內(nèi)的變異系數(shù)(CV)在4.2％～7.0％之間，批間CV在6.6％～7.4％之間;它們的值均小于10％，表明本方法的重復(fù)性好。將濃度為0.174mg/mL的抗Sczy3雞IgG用0.1％BSA做2倍系列稀釋，用本方法對(duì)稀釋液進(jìn)行檢測(cè)，抗S

6、czy3 IgG的最低檢出率量為1.359μg/mL。用本方法和IDEXX試劑盒對(duì)22頭份IBV抗體陽(yáng)性血清和8頭份IBV抗體陰性血清進(jìn)行平行檢測(cè)，本方法的檢測(cè)符合率為93.3％。在4℃環(huán)境溫度下，本方法所用的預(yù)包被反應(yīng)板，酶標(biāo)兔抗雞IgG-HRP和陰陽(yáng)對(duì)照血清和其他相關(guān)試劑的保存期為12個(gè)月，初步完成了試劑盒組裝。
　　本試驗(yàn)建立了綜合使用鋅酸硫酸銨-DEAE-52-纖維素離子交換層析-SephadexG200凝膠層析提純雞、兔