宿主SRC調(diào)控雞傳染性喉氣管炎病毒感染的機(jī)制研究.pdf

1、雞傳染性喉氣管炎（Avian infectious laryngotracheitis，AILT）是由雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）引發(fā)的一種雞的上呼吸道疾病，該病給養(yǎng)禽業(yè)國(guó)家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其病原ILTV是一種皰疹病毒，在感染機(jī)體后造成潛伏感染從而逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，導(dǎo)致目前基于激發(fā)宿主免疫應(yīng)答而產(chǎn)生防控效果的各類疫苗都難以長(zhǎng)效地防控本病，因此探索防制AILT的

2、新策略至關(guān)重要。
　　研究ILTV與宿主間的相互作用尤其是ILTV在細(xì)胞間的傳播可為防制AILT提供新思路。前期研究表明，宿主SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）是ILTV感染細(xì)胞過(guò)程中主要的調(diào)節(jié)因子，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。為此我們先用兩種小分子抑制劑PP1和PP2阻斷SRC，實(shí)時(shí)激光共聚焦成像顯示抑制SRC可促進(jìn)ILTV在細(xì)胞間傳播，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)分別對(duì)SRC抑制后ILTV-EGFP感染的EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和

3、EGFP熒光面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示兩者均顯著增多（p＜0.05），用RNA干擾的方法沉默SRC后也得到了相同的結(jié)果。病毒在細(xì)胞間傳播分為游離傳播和細(xì)胞-細(xì)胞間傳播兩種，為了深入了解抑制SRC促進(jìn)ILTV在細(xì)胞間傳播的主導(dǎo)因素，我們通過(guò)qPCR和TCID50的方法檢測(cè)了SRC抑制后ILTV感染24 h內(nèi)細(xì)胞上清中的病毒載量與滴度，結(jié)果顯示ILTV含量極低且不存在顯著差異，而在細(xì)胞上清中加入ILTV中和抗體后對(duì)ILTV-EGFP感染24 h

4、內(nèi)的EGFP熒光面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示SRC抑制后EGFP熒光面積依然顯著增多(p＜0.05)，以上結(jié)果說(shuō)明抑制SRC促進(jìn)LLTV在細(xì)胞間傳播不依賴于病毒的游離傳播，但可能依賴于細(xì)胞-細(xì)胞間傳播，而后者包括病毒吸附、病毒進(jìn)入和病毒在細(xì)胞-細(xì)胞間傳播三種情況，我們分別針對(duì)三種情況進(jìn)行了檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，抑制SRC可促進(jìn)ILTV進(jìn)入細(xì)胞，但對(duì)ILTV吸附細(xì)胞沒(méi)有顯著影響。為了進(jìn)一步了解ILTV在細(xì)胞-細(xì)胞間傳播的機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了感染

5、細(xì)胞與未感染細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)感染細(xì)胞增殖和細(xì)胞間胞質(zhì)直接聯(lián)系對(duì)抑制SRC促進(jìn)ILTV在細(xì)胞間傳播這一過(guò)程影響均不顯著，抑制SRC促進(jìn)ILTV在細(xì)胞間傳播主要由感染細(xì)胞內(nèi)SRC抑制而引發(fā)。為了進(jìn)一步從分子水平闡述其中的機(jī)制，我們?cè)谝种扑拗鱏RC情況下對(duì)病毒感染24 h的全基因組轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合生物信息學(xué)分析推測(cè)，抑制SRC促進(jìn)ILTV在細(xì)胞間傳播與Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路中的MEK

6、及p38通路有關(guān)。為了驗(yàn)證我們的推測(cè)，我們分別在ILTV-EGFP感染前和感染后對(duì)三個(gè)信號(hào)通路都各自用了兩種小分子抑制劑進(jìn)行阻斷，然后檢測(cè)在宿主SRC抑制情況下ILTV-EGFP在細(xì)胞間的傳播情況。結(jié)果表明，MEK信號(hào)通路阻斷后，抑制SRC依然促進(jìn)ILTV-EGFP在細(xì)胞間傳播，而Akt和p38MAPK信號(hào)通路阻斷后，抑制SRC對(duì)ILTV-EGFP在細(xì)胞間傳播無(wú)顯著促進(jìn)作用，這說(shuō)明MEK信號(hào)通路并未參與SRC對(duì)ILTV在細(xì)胞間傳播的調(diào)控