雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因重組DNA疫苗的構(gòu)建與雞IL-18聯(lián)合免疫試驗(yàn).pdf

1、雞傳染性喉氣管炎(ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起雞的一種急性、高度接觸性上呼吸道傳染病，呈全球性流行，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。目前國(guó)內(nèi)外防制本病普遍采用弱毒疫苗。這些疫苗的毒力普遍偏強(qiáng)，可以在雞體內(nèi)潛伏感染，而且在雞體傳代過程中毒力返強(qiáng)。因此，研制更安全而有效的疫苗，將有利于徹底控制乃至根除ILT。
　　 自從1990年出現(xiàn)基因免疫以來，許多病毒的不同基因?qū)敫鞣N動(dòng)物體內(nèi)，產(chǎn)生了很好的免疫效果。DNA疫苗作

2、為第3代疫苗，因其既有亞單位疫苗的安全性，又有減毒活疫苗的有效性而受到研究人員的矚目。但是DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平低，還不能完全有效抵抗致死劑量病原體的攻擊。怎樣增強(qiáng)免疫保護(hù)效果顯得尤為緊迫。許多研究已經(jīng)表明，細(xì)胞因子具有明顯的免疫增強(qiáng)作用，包括IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-18等。
　　 本研究根據(jù)已發(fā)表的ILTV SA2疫苗株gB基岡序列(M64927)設(shè)計(jì)、合成了1對(duì)引物，以ILTVCG株基因組DNA為模板

3、擴(kuò)增gB基因，并進(jìn)行克隆和測(cè)序。根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和ILTVgB全基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)、合成1對(duì)引物，PCR擴(kuò)增ILTVgB全基因。將EcoRI和XhoI酶切獲得的gB基因片段克隆到經(jīng)同樣處理的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/gB。根據(jù)pGEM-ChIL-18設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上、下游引物分別加入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增IL-18全基因核苷酸序列，將該基岡片段重組到真

4、核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/IL-18。
　　 為測(cè)定構(gòu)建的編碼ILTV糖蛋白gB基因的重組DNA疫苗與雞IL-18聯(lián)合免疫的試驗(yàn)效果，將pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/IL-18分別或聯(lián)合免疫21日齡SPF雛雞，兩周后加強(qiáng)免疫。首免后每周抽取外周血及外周抗凝血，應(yīng)用ELISA和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)免疫雞的體液免疫及細(xì)胞免疫水平。二免疫后第3周用100ELD50ILTV強(qiáng)毒進(jìn)

5、行攻擊。結(jié)果顯示，pcDNA3.1/gB和pcDNA3.1/gB與pcDNA3.1/IL-18聯(lián)合免疫組均能誘導(dǎo)雞產(chǎn)生特異性的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中以pcDNA3.1/gB與pcDNA3.1/IL-18聯(lián)合免疫組的T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明顯高于單獨(dú)pcDNA3.1/gB免疫組(P＜o(jì)．01)，87％抵抗ILTV強(qiáng)毒的致死性攻擊。
　　 本試驗(yàn)采用的真核雙表達(dá)載體pIRES，是雙順反子結(jié)構(gòu)

6、，具有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)。將雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的gB基因和雞白介素18(IL-18)基因分別或同時(shí)插入雙順反子質(zhì)粒pIRES中，在啟動(dòng)子下游的MCSA的酶切位點(diǎn)XhoI與MluI之間插入雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因片段，在MCSB的酶切位點(diǎn)SalI與Not I之間插入雞白介素-18基因片段，獲得表達(dá)ILTV gB基因的pIRES/gB質(zhì)粒、表達(dá)雞白介素-18基因的pIRES/IL-18質(zhì)粒及共表達(dá)質(zhì)粒pIRES/gB/IL18