傳染性法氏囊病病毒對CEF細胞某些基因表達的影響和傳染性喉氣管炎病毒的重組.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文傳染性法氏囊病病毒對CEF細胞某些基因表達的影響和傳染性喉氣管炎病毒的重組姓名：李義平申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：張曼夫20040501中國農(nóng)業(yè)大學博二L 學位論文或F 5 2 f T 0 攻毒的雞的法氏囊中，不能檢測出w l B D V 幣lF 5 2 ／7 0 ，只在一些雞中檢測出D 7 8 。此方法可應用于I B D V 的分型，也可以對同一組織中不同類型的I B D V 進行定量

2、研究。實驗結果對I B D V的致病性和I B D V 與宿主相互作用研究提供了重要的參考信息。第二部分：實驗克隆了中國l L l ‘VE 2 株的帶側翼序列的T K 基因，得到質粒p C R T - 兀l K ，并進行序列分析。然后用A c c I I I 和V a n 9 1 I 刪除T K 基因內(nèi)部6 7 7b p 的序列。在此刪除位點分別插入C M V - G F P —p o l y A 和S V 4 0 - G F P -

3、p o l y A 表達盒分別得到質粒p F T K - S G 和p F T K - S G 。將新城疫融合基因( F ) 分別插入到質粒p F T K - C G 和p F T K - S G 中的G F P 的上游，與G F P 構成融合表達框，得到質粒p F T - C F G 和p F T _ S F G 。另外，構建T K 缺失的不帶外源基因的重組質粒p F T K D 。用質粒p F T K - C G p F T K -

4、 S G , p F T - C F G 和p F T - S F G 與I L T V 基因組D N A 共轉染L M H 細胞和雞原代肝細胞，用熒光顯微鏡檢測帶熒光的I L l l V 重組子。病毒重綢子在雞原代肝細胞中傳第二代時，還可見到熒光，說明帶G F P 和F - ( 3 F P 的重組I L T V 在轉染時已經(jīng)產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)C M V 啟動予比S V 4 0 啟動子有更強的啟動效率。重組子的純化與性質測定有待進一步鑒定。第三

5、部分：應用R T - P C R 結合探針雜交的方法對新城疫病毒( N D V ) 進行分型。先用感染N D v 的雞胚尿囊液建立實驗方法，再用感染雞的組織進行該方法的應州效能檢測。V C 2 2 是毒力株特異探針，N C 2 2 是非毒力株特異探針．用地高辛( D I G ) 標記探針3 ’端．在尼龍膜上與N D VR T - P C R 產(chǎn)物進行斑點雜交。兩個探針能很好的區(qū)分來自感染雞胚尿囊液的N D V ，并可區(qū)分感染組織中的N

6、D V強弱毒。對各毒株的雜交檢測結果與腦內(nèi)致病指數(shù)( I C P I ) 判定的強弱毒結果相一致，整個檢測過程可在j 天內(nèi)完成。實驗對兩個探針的特異性和N C 2 2 的靈敏度進行測試．N C 2 2 能檢測到將1 0 7 。5E I D s o ，m l 的L a S o t a 毒株稀釋到1 0 4 稀釋度或8 0 0 龜?shù)牟《綬 N A 。本系統(tǒng)在臨床樣品的檢測上有一定的麻用價值。關鍵j 司：傳染性法氏囊病病毒，定量實時R T —