雞傳染性法氏囊病病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白的克隆與表達(dá).pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一，該病主要侵害雛雞的中樞免疫器官-法氏囊，造成免疫抑制，給養(yǎng)雞企業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 IBD于1957年首次在美國特拉華州甘布羅鎮(zhèn)(Gumboro)的肉雞群中發(fā)現(xiàn)，于20世紀(jì)80年代在歐

2、洲國家首先報(bào)道有超強(qiáng)毒株(vvIBDV)和變異株的出現(xiàn)，于90年代初vvIBDV傳至中國及亞洲其它國家和地區(qū)。隨著變異株、超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，該病的發(fā)生與流行不斷出現(xiàn)新的特點(diǎn)，給該病的診斷與防治帶來了更多的困難，引起了人們的高度關(guān)注。 近年來，IBDV的分子生物學(xué)研究己取得了較大進(jìn)展，但在分子水平對雞傳染性法氏囊病病毒的免疫機(jī)理、致病機(jī)制、病毒分子結(jié)構(gòu)與功能方面仍然有許多問題有待于進(jìn)一步深入研究，鑒定IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白的功能有助于

3、揭示病毒與機(jī)體相互作用的本質(zhì)，從而了解IBDV的致病機(jī)制和免疫機(jī)理；表達(dá)的主要結(jié)構(gòu)蛋白為進(jìn)一步制備單克隆抗體，進(jìn)而研制快速診斷試劑盒以及多表位疫苗打下了基礎(chǔ)。 本研究共分三個(gè)部分： 試驗(yàn)一免疫雞群中IBDV山東地方株的分離鑒定 從山東地區(qū)采集已免疫過IBDV疫苗，但又表現(xiàn)出IBD臨床癥狀的病雞病料，根據(jù)病雞發(fā)病的流行特點(diǎn)和臨床癥狀，結(jié)合病毒分離、組織病理學(xué)觀察、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、IB

4、DV VP2基因的序列同源性分析等結(jié)果，確定雞場的疫情是由感染IBDV野毒引起，該分離株命名為IBDV SD株。 試驗(yàn)二 IBDV SD株主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因在BL21(DE3)plysS中的表達(dá)及免疫血清的制備 IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因既是主要保護(hù)性蛋白，又與病毒的致病性相關(guān)，本研究利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因，并將其克隆到原核表達(dá)載體PGEX-4T-3中，獲得重組質(zhì)粒命名為PGEX

5、-VP2，經(jīng)PCR、酶切和序列分析鑒定表明：插入的位置、大小和讀碼框均正確。SDS-PAGE電泳檢測表明，經(jīng)重組質(zhì)粒PGEX-VP2轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)的受體菌E.coli BL21(DE3)plysS能表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因，約69KDa，表達(dá)的蛋白經(jīng)純化后免疫6周齡BALB/c小鼠，ELISA分析表明制備的抗血清效價(jià)在1：5120以上，Western blot分析表明VP2表達(dá)產(chǎn)物能與IBDV抗血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的免疫原性，為單克隆抗體的

6、制備及快速診斷試劑盒的制備奠定了基礎(chǔ)。 試驗(yàn)三 IBDV SD株主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因的克隆表達(dá)與生物學(xué)活性的鑒定 為研究IBDV SD株主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因與致病性及免疫原性的相關(guān)性，本研究利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因，將其克隆到原核表達(dá)載體pET32a中，獲得重組質(zhì)粒，命名為pET-VP3，經(jīng)PCR、酶切和序列分析鑒定表明：插入的位置、大小和讀碼框均正確。SDS-PAGE檢測表明，經(jīng)重組質(zhì)

7、粒pET-VP3轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)的受體菌BL21(DE3)能表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因，并以包涵體形式存在，蛋白約為57KDa，經(jīng)Westernblot等檢測表明，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白能與IBDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。 通過切膠純化蛋白，并將純化的蛋白免疫SPF雞，然后以點(diǎn)眼滴鼻的形式攻毒，結(jié)果表明：注射VP3表達(dá)蛋白的雞能抵御IBDV強(qiáng)毒的攻擊，說明IBDV VP3基因不但具有很好的免疫原性，而且還具有一定的免疫保護(hù)作用，為血清學(xué)診斷和下一