雞體抗傳染性法氏囊病病毒天然免疫基因的miRNA調(diào)控機(jī)制.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。天然免疫(innate immunity)是機(jī)體防御病原體感染的第一道防線，在啟動機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答中起著十分重要的作用。microRNA(miRNA)是一種21～25nt的小分子RNA，是基因表達(dá)的調(diào)控子，本研究以IBDV為模式

2、病毒，探討了miRNA在機(jī)體中調(diào)控干擾素、p53和模式識別受體抗IBDV天然免疫的分子機(jī)制。
　　1傳染性法氏囊病病毒對雞法氏囊組織中干擾素和p53轉(zhuǎn)錄的影響
　　為了分析傳染性法氏囊病病毒(IBDV)感染雞體內(nèi)干擾素和p53轉(zhuǎn)錄水平差異變化，用IBDV弱毒(B87)和強(qiáng)毒(QL/12)分別感染4周齡SPF雞，每隔12h時(shí)(12～84h)取3只雞的法氏囊組織混合勻漿，用熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測其感染前后干擾

3、素(IFN)和p53的mRNA水平，同時(shí)分析法氏囊組織的病理變化和病毒載量。結(jié)果顯示:QL/12組，IFN-α和IFN-β mRNA水平隨著時(shí)間的增加逐漸升高，48h達(dá)到峰值，隨后降低;IFN-γ mRNA水平隨著時(shí)間的增加逐漸升高，60h達(dá)到峰值，隨后逐漸降低;p53 mRNA含量迅速升高，60h達(dá)到峰值（比正常SPF雞高約90倍），隨后降低。B87組，IFN-α mRNA水平先降低后升高(48h達(dá)到最低值)，而IFN-β mRNA水

4、平變化不規(guī)則，72h含量最高;IFN-γ mRNA水平先逐漸升高后降低（72h達(dá)到峰值）;p53 mRNA含量變化較小，36h含量最高（比正常SPF雞高約5倍）;QL/12組誘導(dǎo)法氏囊組織產(chǎn)生的IFN mRNA(IFN-α、IFN-β和IFN-γ mRNA)以及p53mRNA水平均顯著高于B87-IBDV組。病理組織學(xué)檢查可見:與正常對照組相比，QL/12組法氏囊淋巴濾泡呈不同程度的損傷，B87組法氏囊組織未見明顯的組織病變。qRT-P

5、CR檢測IBDV病毒載量，QL/12組法氏囊組織中病毒含量48h達(dá)到峰值(8.4×106copies/mg)，而B87組法氏囊組織中病毒含量72h達(dá)到峰值(6.6×104copies/mg)。本研究為分析雞體內(nèi)IFN和p53介導(dǎo)的抗IBDV天然免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　2雞p53抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制及gga-miR-2127對其調(diào)控機(jī)制
　　傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD

6、)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。腫瘤抑制蛋白p53能夠抑制多種病毒的復(fù)制，但對IBDV復(fù)制的影響仍然不清楚。本研究以IBDV為模式病毒，采用體外感染模式，在IBDV感染的DF-1細(xì)胞中，p53的表達(dá)水平和活性均顯著升高。p53過表達(dá)可以抑制IBDV的復(fù)制，并激活雞體抗病毒天然免疫基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表達(dá)水

7、平上調(diào);p53抑制表達(dá)則得到相反的結(jié)果;表明p53可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應(yīng)發(fā)揮抗IBDV感染作用。用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-2127可以作用于p53的3'UTR;qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-2127可以使p53的蛋白水平表達(dá)降低，但mRNA水平?jīng)]有變化;gga-miR-2127過表達(dá)可以使雞體的抗病毒天然免疫基因表達(dá)降低，IBDV復(fù)制水平升高。本研究表明:gga-miR-21

8、27可以作用于p53的3'UTR調(diào)控p53的表達(dá)來發(fā)揮抗IBDV感染的作用。
　　3 gga-miR-9*靶向IRF2促進(jìn)傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的分子機(jī)制
　　為研究gga-miR-9*對傳染性法氏囊病病毒(IBDV)復(fù)制的影響，本研究用化學(xué)合成的方法合成gga-miR-9*的模擬物gga-miR-9* mimics，轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，24h后，接種IBDV，48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，測定IBDV的滴度，結(jié)果顯示，gg

9、a-miR-9* mimics能夠促進(jìn)IBDV的復(fù)制。通過對病毒感染后的IFN檢測分析，發(fā)現(xiàn)gga-miR-9*可負(fù)調(diào)控干擾素(IFN)的產(chǎn)生;進(jìn)一步用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析驗(yàn)證，gga-miR-9*可靶向調(diào)控干擾素調(diào)控基因2(IRF2)。用western blot和qRT-PCR分析，gga-miR-9* mimics轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞中IRF2蛋白和mRNA水平均比正常DF-1細(xì)胞顯著降低，將細(xì)胞中的IRF2基因敲除

10、，IBDV復(fù)制滴度((10625TCID50/0.1 mL))顯著高于miRNA對照組((105.25TCID50/0.1 mL))，表明細(xì)胞gga-miR-9*促進(jìn)IBDV復(fù)制的分子作用機(jī)理是在IRF2基因轉(zhuǎn)錄后水平上抑制細(xì)胞天然免疫功能而發(fā)生的。
　　4傳染性法氏囊病病毒感染對雞細(xì)胞模式識別受體及抗病毒基因轉(zhuǎn)錄的影響
　　為研究傳染性法氏囊病病毒(IBDV)感染對雞細(xì)胞模式識別受體(PRRs)及天然免疫抗病毒基因轉(zhuǎn)錄的影

11、響，本實(shí)驗(yàn)分別用IBDV弱毒感染DT40細(xì)胞和強(qiáng)毒感染SPF雞，以定量PCR(qRT-PCR)檢測感染細(xì)胞和法氏囊組織中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的mRNA轉(zhuǎn)錄變化。在IBDV感染DT40細(xì)胞的2h到24h內(nèi)，chMDA5、chTLR3、chLGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，分別為324、22、61、2

12、9、16、225000和18700倍。當(dāng)用siRNA分別敲除DT40細(xì)胞中chMDA5、chTLR3和chLGP2時(shí)，IPS-1、IRF3、PKR、OAS和Mx在IBDV感染后的2h到24h差異變化不顯著。在IBDV感染SPF雞法氏囊組織細(xì)胞中，chMDA5和chTLR3的表達(dá)顯著降低，而chLGP2表達(dá)沒有顯著差異，IRF3、PKR、OAS和Mx的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。TLR4和TLR7在IBDV的體外和體內(nèi)感染試驗(yàn)中均未檢測到，而IPS

13、-1在IBDV的體外和體內(nèi)感染試驗(yàn)中均變化不顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，chMDA5、chTLR3和chLGP2在識別IBDV的感染中起著關(guān)鍵作用，IBDV感染嚴(yán)重抑制了雞細(xì)胞模式識別受體chMDA5和chTLR3的轉(zhuǎn)錄，并且提示其抑制作用在體內(nèi)與體外可能存在不同的分子機(jī)制。
　　5 gga-miR-142-5p調(diào)控chMDA5抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的機(jī)制
　　傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染

14、病。chMDA5在識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)及激活宿主的天然免疫應(yīng)答中具有重要的作用，但chMDA5識別IBDV的分子機(jī)制仍然不清楚。本研究以IBDV為模式病毒，采用體外感染模式，在IBDV感染的DT40細(xì)胞中，chMDA5的表達(dá)水平顯著升高。chMDA5過表達(dá)可以抑制IBDV的復(fù)制，并激活I(lǐng)FN-β promoter和Mx promoter活性，chMDA5抑制表達(dá)則得到相反的結(jié)果;且chMDA5激活I(lǐng)FN-β promote

15、r活性主要是通過IRF7通路;表明chMDA5可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應(yīng)發(fā)揮抗IBDV感染作用。用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3'UTR; qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-142-5p可以使chMDA5的蛋白水平表達(dá)降低，但mRNA水平?jīng)]有變化;gga-miR-142-5p過表達(dá)可以使IFN-β promoter和Mx promoter活性降低;IR