傳染性喉氣管炎病毒gD、gE、gJ基因的表達(dá)與間接ELISA方法的建立.pdf

1、禽傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是雞的一種以呼吸困難、咳出血樣黏液、喉部和氣管黏膜水腫出血并導(dǎo)致糜爛為主要特征的病毒性呼吸道傳染病,可致感染雞的死亡和產(chǎn)蛋下降,是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一.傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)野毒和弱毒疫苗都可以造成潛伏感染,成為傳染源,使本病持續(xù)存在,并形成區(qū)域流行.本研究通過表達(dá) ILTV 三個(gè)重要結(jié)構(gòu)蛋白并純化和建立間接ELISA方法,以篩選合適的診斷抗

2、原并建立間接ELISA方法,用于ILTV野毒感染的血清學(xué)檢測(cè). 本研究首先克隆和測(cè)序了ILTV WG 株 gJ 基因,gJ完整開放閱讀框大小為2988bp,比ILTVUSDA株多30bp,推測(cè)編碼的氨基酸序列單獨(dú)形成一個(gè)表位.隨后,通過PCR擴(kuò)增出ILTV三重要囊膜糖蛋白gD、gE和gJ的主要抗原性區(qū)域,連接到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在E.coliBL21 (DE3)中表達(dá),三重組蛋白r-gD、r-gE和r-g

3、J都有可溶性蛋白存于上清中,經(jīng)His單克隆抗體鑒定后,非變性條件下用Ni樹脂純化r-gD、r-gE和r-gJ,ILTV陽性血清和制備的兔抗r-gD、r-gE、r-gJ單因子血清證實(shí)r-gD、r-gE和r-gJ都保留了抗原性. 然后,對(duì)純化的r-gD、r-gE和 r-gJ 進(jìn)行了間接 ELISA 條件的探索,優(yōu)化抗原濃度,血清稀釋度,酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)和封閉液;根據(jù)36份SPF陰性血清,按陰陽性臨界值=陰性血清OD<,405>平均值

4、+3×SD,確立了r-gD、r-gE和r-gJ間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn);完成了特異性試驗(yàn)和符合性試驗(yàn),r-gD、r-gE和r-gJ間接ELISA對(duì)139份血清樣品的檢測(cè)結(jié)果與全病毒間接ELISA的符合率分別為92.8﹪、77.0﹪和77.0﹪;對(duì)試驗(yàn)感染ILTV WG株的SPF雞血清進(jìn)行檢測(cè),r-gD、r-gE和r-gJ間接ELISA都能檢測(cè)出明顯的抗體變化曲線,其中r-gD間接ELISA能夠更合理的反映ILTV感染后機(jī)體的體液免疫狀況.