傳染性喉氣管炎病毒gD、gE、gJ基因的表達與間接ELISA方法的建立.pdf

1、禽傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是雞的一種以呼吸困難、咳出血樣黏液、喉部和氣管黏膜水腫出血并導致糜爛為主要特征的病毒性呼吸道傳染病,可致感染雞的死亡和產(chǎn)蛋下降,是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一.傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)野毒和弱毒疫苗都可以造成潛伏感染,成為傳染源,使本病持續(xù)存在,并形成區(qū)域流行.本研究通過表達 ILTV 三個重要結(jié)構(gòu)蛋白并純化和建立間接ELISA方法,以篩選合適的診斷抗

2、原并建立間接ELISA方法,用于ILTV野毒感染的血清學檢測. 本研究首先克隆和測序了ILTV WG 株 gJ 基因,gJ完整開放閱讀框大小為2988bp,比ILTVUSDA株多30bp,推測編碼的氨基酸序列單獨形成一個表位.隨后,通過PCR擴增出ILTV三重要囊膜糖蛋白gD、gE和gJ的主要抗原性區(qū)域,連接到原核表達載體pET-32a(+)中,經(jīng)IPTG誘導在E.coliBL21 (DE3)中表達,三重組蛋白r-gD、r-gE和r-g

3、J都有可溶性蛋白存于上清中,經(jīng)His單克隆抗體鑒定后,非變性條件下用Ni樹脂純化r-gD、r-gE和r-gJ,ILTV陽性血清和制備的兔抗r-gD、r-gE、r-gJ單因子血清證實r-gD、r-gE和r-gJ都保留了抗原性. 然后,對純化的r-gD、r-gE和 r-gJ 進行了間接 ELISA 條件的探索,優(yōu)化抗原濃度,血清稀釋度,酶標二抗稀釋倍數(shù)和封閉液;根據(jù)36份SPF陰性血清,按陰陽性臨界值=陰性血清OD<,405>平均值

4、+3×SD,確立了r-gD、r-gE和r-gJ間接ELISA判定標準;完成了特異性試驗和符合性試驗,r-gD、r-gE和r-gJ間接ELISA對139份血清樣品的檢測結(jié)果與全病毒間接ELISA的符合率分別為92.8﹪、77.0﹪和77.0﹪;對試驗感染ILTV WG株的SPF雞血清進行檢測,r-gD、r-gE和r-gJ間接ELISA都能檢測出明顯的抗體變化曲線,其中r-gD間接ELISA能夠更合理的反映ILTV感染后機體的體液免疫狀況.