禽傳染性支氣管炎病毒多基因串聯(lián)表位抗原的構(gòu)建表達(dá)與ELISA方法初探.pdf

1、禽傳染性支氣管炎（Avian Infectious Bronchitis，IB）是由禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性的傳染病。IBV主要免疫原是三種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白S1、膜蛋白M和核蛋白N，常用于IBV抗體檢測(cè)。IBV抗體檢測(cè)方法很多，主要有血凝抑制試驗(yàn)(HI)、中和試驗(yàn)(NT)、對(duì)流免疫試驗(yàn)(CIE)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELI

2、SA)。由于IBV血清型的多樣性與變異性，再加上病毒提純難度大，使得現(xiàn)在的IBV抗體檢測(cè)方法不是靈敏度低就是成本高，本課題設(shè)計(jì)了IBV多表位抗原，通過(guò)構(gòu)建、鑒定與原核表達(dá)，初步建立了以多表位蛋白為抗原的IBV間接ELISA檢測(cè)方法。
　　 1、利用生物信息學(xué)軟件分析了IBVM41毒株S1、M、N結(jié)構(gòu)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、表面可能性，以及不同毒株間的同源性。綜合考慮以上各方面因素，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，共篩選出IBV抗原表位4段

3、D1-D4(S1:221-356，M:165-200,N:118-270，913-1200)。利用柔性肽將4個(gè)片段依次串聯(lián)成多表位抗原D。分析表明，設(shè)計(jì)的IBV多表位抗原基因D具有有良好的親水性、柔性及抗原性等。并成功構(gòu)建了IBV多表位抗原基因，經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序鑒定正確。
　　 2、IBV多表位抗原在大腸桿菌中的表達(dá)，將IBV多表位抗原基因用BamHI和XhoI雙酶切后克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化E.coliB

4、L21，采用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE鑒定表明，多表位抗原大部分在上清中融合表達(dá)，同時(shí)也存在包涵體形式，分子量大小約為63KD，通過(guò)優(yōu)化重組質(zhì)粒的表達(dá)條件，多表位蛋白表達(dá)的最佳IPTG誘導(dǎo)物濃度為0.5mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為5h，誘導(dǎo)溫度為37℃，表達(dá)蛋白點(diǎn)上清中總蛋白量的12％。Western-blots顯示，該融合蛋白能與抗IBV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。3、以純化的原核表達(dá)的多表位抗原蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，篩選出多表位抗原