禽呼腸孤病毒和傳染性支氣管炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的研究.pdf

1、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，僅需一個簡單的恒溫反應(yīng)器就能夠在等溫條件下高效、快速對DNA進(jìn)行擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù)。本研究建立了禽呼腸病毒(Avian reovirus,ARV)的LAMP檢測方法。基于禽呼腸病毒的p10基因8個區(qū)域的6條LAMP引物，能夠在等溫（63℃）條件下1h內(nèi)完成反應(yīng)，具有良好的敏感性和特異性，最低能夠檢出10

2、2個拷貝的病毒，敏感性比普通PCR高100倍，而對其他病毒檢測結(jié)果為陰性。在熒光顯色中分別應(yīng)用SYBR Green I和鈣黃綠素作為顯色劑，其結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳一致。在對80份臨床陽性樣本的檢測中，使用LAMP和PCR檢測出陽性樣本的數(shù)量分別為68份和55份。同時，本研究還建立了傳染性支氣管炎病毒(IBV)的5a+5b基因序列8個區(qū)域的6條LAMP引物設(shè)計一套LAMP引物,建立了一種基于熒光顯色的IBV逆轉(zhuǎn)錄環(huán)等溫擴(kuò)增檢測方法。該方法

3、能夠在等溫（63℃）條件下1h完成反應(yīng)。該方法具有良好的敏感性和特異性，能夠檢出1個拷貝的陽性重組質(zhì)粒，比普通PCR高100倍，而不能檢出其他病毒。用HNB進(jìn)行反應(yīng)顯色，其結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳一致。在對60份臨床陽性樣本檢測中，使用LAMP和PCR檢測的檢出率分別為49份和42份。與PCR相比，LAMP快速，操作簡便、成本低廉，只需要一個小時就能完成檢測。另外，通過添加顯色劑，在反應(yīng)結(jié)束后即可直接觀測判定結(jié)果。鑒于LAMP的諸多優(yōu)點，本