禽傳染性支氣管炎病毒M基因自殺性DNA疫苗及免疫效應(yīng)研究.pdf

1、自殺性DNA疫苗是指將引起免疫應(yīng)答的目的基因片段插入以甲病毒為基礎(chǔ)的質(zhì)粒載體構(gòu)建而成的一種新型DNA疫苗，它可引起宿主細(xì)胞調(diào)亡，并且通過抗原的高效表達(dá)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是更為安全有效的基因工程疫苗。雞傳染性支氣管炎病毒重要免疫原基因之一的M基因上存在重要的抗原決定簇，且具有高度保守性。M基因與病毒的復(fù)制有關(guān)，大小約700bp。已有的IBV疫苗文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于M基因免疫效應(yīng)的研究較少。本研究通過PCR擴(kuò)增在兩端引入BamH I酶切位點(diǎn)，

2、經(jīng)酶切插入自殺性DNA疫苗載體pSCAl，構(gòu)建了自殺性DNA疫苗pSCAl-M質(zhì)粒，經(jīng)由菌落PCR、酶切及測序鑒定目的基因被成功克隆至自殺性DNA疫苗載體pSCAl，且方向正確。以1：20的配比加入脂質(zhì)體作佐劑，制備了工BV M基因的自殺性DNA疫苗。分別取等量的重組質(zhì)粒pSCAl-M、常規(guī)IBV M基因DNA疫苗質(zhì)粒pcDNAM、空載體pSCAl轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。48h后經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，pSCA-M以及pcDNAM轉(zhuǎn)染組細(xì)

3、胞漿均可見特異性亮綠色熒光，pSCAl空載體組無熒光為陰性。證實(shí)自殺性DNA疫苗載體能成功表達(dá)M基因。 為評價(jià)IBV自殺性DNA疫苗的免疫效應(yīng)，分別用構(gòu)建的自殺性DNA疫苗pSCAl-M、常規(guī)DNA疫苗pcDNAM、空載體pSCAl和IBV滅活疫苗免疫非免疫原健康雛雞，對照組注射PBS液。自免疫后每周采血分離血清連續(xù)五周，采用間接ELISA試驗(yàn)檢測血清特異性抗體IgG，結(jié)果表明：自殺性DNA疫苗產(chǎn)生針對IBV的特異性血清抗體，免

4、疫后第三周上升到峰值，隨后開始下降，其抗體水平與常規(guī)IBV DNA疫苗相當(dāng)，低于滅活疫苗。用流式細(xì)胞儀(FACS)測定各組CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>動態(tài)變化，結(jié)果顯示：自殺性DNA疫苗pSCAl-M組CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>各T淋巴細(xì)胞數(shù)量平均水平均高于其余各組，在各個時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為差異顯著(P<0.01或P<0.05)。但在第4周左右有一個明顯的下降，之后又回升。說明自殺性DNA疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體